半导体纳米晶体的光致发光特性及在生物材料荧光标记中的应用-百(精).doc

分析化学(FE NXI H UAX UE 评述与进展第9期2002年9月Chinese Journal of Analytical Chemistry 11301136第30卷评述与进展半导体纳米晶体的光致发光特性及在生物材料荧光标记中的应用孙宝全徐咏蓝衣光舜陈德朴1121312(清华大学化学系, 北京100084 (石油大学化工学院环境中心, 北京102200摘要介绍了半导体纳米晶体(亦称量子点 的结构特征和光致发光特点, 并与有机荧光染料分子的光致发光性质作了对比。结合本实验室所做的工作, 对半导体纳米晶体用于生物材料的连接、。关键词半导体纳米晶体, 荧光, 生物材料, 标记, 评述1引言, 尤其是在光学和生1物学方面, 。国际上许多高水平的期刊如Science 和Nature 、物理化学特征和其在生物医学和光电子领。, 并计划于T M 92001QDOT 产品。82半导体纳米晶体的结构和特征半导体纳米晶体是由数目极少的原子或分子组成的原子或原子团簇。目前文献中报道的主要涉及的是主族如CdSe 、如InP 、InAs 和G aAs 副族化合物以及Si 等元素, 特别是和副族化合物尤其引起人们的关注。由于光谱禁阻的影响, 当这些半导体纳米晶体的直径小于其玻尔直10径(一般小于10nm 时, 这些小的半导体纳米晶体就会表现出特殊的物理和化学性质, 如Si 纳米晶体1112和多孔Si 可发光, 晶体的大小会影响晶体的晶相结构和熔点。半导体纳米晶体的结构导致了它具有尺寸量子效应和介电限域效应并由此派生出半导体纳米晶体独特的发光特性。半导体的光致发光原理如图1所示。当一束光照射到半导体上时, 半导体吸收光子后价带上的电子跃迁到导带, 导带上的电子可以再跃迁回到价带, 放出光子; 也可以落入半导体中的电子陷阱。当电子落入较深的电子陷阱后, 绝大部分以非辐射的形式而淬灭了, 只有极少数的电子以光子的形式跃迁回价带或非辐射的形式回到导带。所以, 当半导体中的电子陷阱较深时, 量子产率就会较低。2. 1尺寸量子效应半导体纳米晶体是尺寸小于100nm 的超微粒。在纳米尺度范围内, 半导体纳米晶体随着其粒径的减小, 会呈现量子化效应, 显示出与块体不同的光学和电学性质。块状半导体的能级为连续的能级, 如图1所示。当颗粒减小时, 半导体的载流子被限制在一个小尺寸的势阱中, 在此条件下, 导带和价带过渡为分立的能级(图1 , 因而使得半导体有效能级差增大, 吸收光谱阈值向短波方向移动, 这种效应就称为尺寸量子效应。任何一种材料, 都存在一个临界晶体大小限制, 小于该尺寸的晶体的光学和电学性质产生巨大变化。与金属导体、绝缘体和范德华晶体相比, 半导体纳米晶体带宽较大, 受量子尺寸效应13,14的影响非常明显, 当颗粒在纳米级时显示出特殊的光学特征。2001208222收稿;2002202211接受本文系国家自然科学基金资助课题(N o. 39989001 第9期孙宝全等:半导体纳米晶体的光致发光特性及在生物材料荧光标记中的应用1131图1Fig. 1Energy transition diagrams of bulk 图中实线表示辐射跃迁, all in s olid lines , and all non 2radioactive ones are 。2. 2, 颗粒表面的原子数目与处于粒子内部的原子数目的比值增加, 。与块状半导体相比, 在半导体颗粒的表面存在更多电子陷阱, 电子陷阱对半导体的光致发光特性起着关键的作用。半导体超微粒表面上修饰某种介电常数较小的材料后, 它们的光学性质与裸露的超微粒相比, 发生了较大变化, 此种效应称为介电限域效应。当介电限域效应所引起的能量变化大于由于尺寸量子效应所引起的变化时, 超微粒的能级差将减小, 反映到吸收15光谱上就表现为明显的红移现象。半导体纳米晶体的表面一般连接有长链的烷基氧化膦(如T OPO 或烷基膦(如T OP , 介电常数小, 使得吸收光谱向长波长移动。将半导体纳米晶体的表面包上一层能级差更大的壳层, 由于介电限域效应也会使得吸收光谱红移。3半导体纳米晶体的发光特性由于尺寸量子效应和介电限域效应的影响, 使得半导体纳米晶体显示出独特的荧光特性。半导体纳米晶体的发光特性具有以下特点:半导体纳米晶体的激发波长的范围较宽, 发射波长的范围较窄, 斯托克斯位移大。半导体纳米晶体具有很高的量子产率, 核壳结构(如在CdSe 纳米颗粒表面在包上一层16InP 层 的半导体纳米晶体的量子产率一般都在30%以上,Peng 等人报道了CdSe CdS 纳米晶体室温下的量子产率可以达到100%。同一种组分的纳米材料, 纳米晶体的粒径不同时, 可以发出不同光(如图2 。用同一波长的光照射不同直径的ZnS CdSe 纳米晶体即可获得从蓝色到红色几乎所有可见波长的光1817。在有机荧光标记试剂中, 很难得到发射波长达800nm 以上的化合物, 纳米晶体InP 、InAs 可以获得7001500nm 多种发射波长的材料, 可填补普通荧光分子在近红外光谱范围内品种少的不19,20足。半导体纳米晶体的发光寿命可达ms 级, 并且不易被光漂白。5,21半导体纳米晶体的形状除球形外, 还有箭头状、泪滴状、棒状等多种形状。Peng 等首次报道了族半导体纳米棒CdSe , 与球形半导体纳米晶体相比, 前者的斯托克斯位移比后者大得多, 同时, 在聚乙烯2丁烯上整齐排列的纳米棒在沿长轴方向上出现极化发射现象, 这将对纳米棒用于生物材料标记时确定标记材料的取向很有帮助。本实验室合成了ZnS CdSe 半导体纳米颗粒, 其荧光光谱如图3所示。通过将CdSe 纳米晶体的表面包覆一层带隙更大的ZnS , 使其荧光量子产率大幅度提高, 可达到50%, 光学稳定性增加, 与CdSe 的光谱相比, 包覆ZnS 的纳米粒子的光谱发生红移。我们通过改变不同的晶体大小, 得到了不同发射波长的1132分析化学22第30卷半导体纳米颗粒。4半导体纳米晶体在生物材料荧光标记中的应用生物材料的标记技术是影响临床检测灵敏度的关键技术。目前, 用于生物材料标记的主要是有机荧光染料。如对基因芯片和蛋白芯片的生物材料T M T M 进行荧光标记的物质主要是花菁染料如Cy3,Cy5等。这类荧光材料与大多数有机荧光染料料一样,量子产率较低, 对检测系统光学部分要求比较严格。较窄的激发波长范围对选择激发光源要求苛刻, 发射波长范围较宽且常在长波长区域拖尾会在不同的检测通道之间带来光谱的相互干扰; 激发波长和发射波长较大程度的重叠, 在检测发射光时会受激发光的影响, 给检测带来了困难。4. 12423图con finement effect , 定, 、pH 、温度等的影响, 可使, 如对其表面进行亲水化处理后可均匀分散于水中。使用与有机荧光分子类似方法可以特异性地用于标记生物材料如细胞、蛋白质和核酸, 并具有更好的荧光特性, 参见表1。半导体纳米晶体的发光寿命比普通荧光标记染料的寿命长12个数量级, 可采取时间分辨技术来检测信号, 这样可大幅度降低背景的强度, 获得较高的信噪比。半导体纳米晶体在生物材料荧光标记领域中的主要优点是可以使用同一激发光源同时进行多通道25的检测。例如, 细胞学家根据细胞结合不同的抗体对细胞进行分类, 分子生物学家需要同时对成千图3两种不同直径的半导体纳米晶体ZnS CdSe 的荧光光谱图上万个DNA 寡核苷酸进行检测, 临床诊断需要对不Fig. 3The fluorescence spectra of tw o kinds of 同的抗体或抗原同时进行检测, 单通道的荧光标记semiconductor nanocrystals with different sizesa. 2. 7nm , b. 4. 4nm 。探针只能对同一样品进行反复多次检测, 费时、费力、费试剂, 有时候甚至是不可能的。虽然可找到具有不同发射波长的有机荧光探针分子, 但同时具有相同激发波长和不同发射波长的有机荧光探针却不多。每种染料分子都需要自己相应的激发光源。半a 表1半导体纳米晶体(ZnS CdSe 与荧光染料(FIT C , R6G 的荧光特性的比较T able 1C omparis on of fluorescence spectral properties of semiconductor nanocrystals (ZnS CdSe and C omm only Used Fluorescent Dye (荧光物质Fluorophores b 量子产率QY b 半高度宽FWH M , nm b 吸收波长b A , nm 发射波长E b , nm 光漂白时间t 12, s 摩尔吸光系数M ole abs orption coefficient , L m ol -1cm -1半导体纳米晶体(S N b 0. 50. 8512300620480630960108ZnS CdSep0. 30. 8549251652572000异硫氰基荧光素(FITC b 3552555510罗丹明6G (R6G b a. 引自文献2,3,24(from references 2,3,24 ; b. S N :semiconductor nanocrystals ; FITC :fluoresein 252is othiocyanate ; R6G:rhodamine 6G; QY:quantum yield ; FWH M:full width at half maximum ; A :absorption wavelength ; E :emission wavelength ; t 12:time constant against photobleaching第9期孙宝全等:半导体纳米晶体的光致发光特性及在生物材料荧光标记中的应用1133导体纳米晶体组成和粒径大小不同时可发出不同波长的光, 发射光谱峰半宽比普通荧光染料窄, 且峰形对称, 这样, 在一个可检测到的光谱范围内可同时使用多个探针。两种核2壳结构的半导体纳米晶体, 一种发出绿色荧光, 另一种发出红色荧光, 用于生物材料标记后用一个激发光源成功进行双通道检测, 更26多的有关多通道检测的工作正在进行中。半导体纳米晶体的发射光谱覆盖从紫外到红外区域, 而很少荧光染料的发射波长能在800nm 以上。对于一些不利于在紫外或可见区域进行检测的生物材料, 可利用半导体纳米晶体标记在红外区域进行检测, 完全避免紫外光对生物材料的伤害, 特别有利于活体生物材料的检测, 同时, 将大幅度降低荧光背景对检测信号的干扰。用发光半导体纳米晶体补充或部分取代有机荧光标记材料, 将开创超灵敏度、高稳定性以及长发光寿命的生物检测技术。近年来, 有报道可大量制备大小分布较为均匀的半导体纳米晶体的方法。另外, 纳米晶体性能稳定, 易于储存和运输, 很适合商品化。4. 2半导体纳米晶体与生物材料的标记方法27, 为了能与DNA 或蛋白质等生物材料相连, 材料相连。其一, 、, 使半导体纳米晶体与巯基3酸络合带上羧基, 、二巯基辛酸等, 如图4所示。Nie 等利用, 使半导体纳米晶体带上羧28, 同时, 羧基可以与带有胺基的生物分子进行连接。Mitchell 等, 再与42(二甲基氨基 2吡啶络合, 半导体纳米晶体的亲水性大幅度增加。亦可以用含多个巯基的分子对半导体纳米晶体的表面进行修饰。如用6,82二巯基辛酸对ZnS CdSe 表面进行处理时, 由于含有两个巯基, 可使6,82二巯基辛酸与半导体纳米晶体表面的结合作用更强, 同时6,82二巯基辛酸的分子较长, 为半导体纳米晶体与生物材料的连接提供了较长的连接29臂, 使二者偶联更容易, 且不破坏标记生物材料的活性。亦可以用含多个羧基的分子对半导体纳米晶体的表面进行修饰。如本实验室采用巯基丁二酸修饰半导体纳米晶体, 由于巯基丁二酸含有两个羧基, 具有更强的亲水性, 使的表面修饰后的半导体纳米晶体可完全溶于水30。图4半导体纳米晶体与生物分子连接的示意图Fig. 4Scheme of semiconductor nanocrytals conjugating with the biological m olecular在图中, 半导体纳米晶体是核(CdSe 壳(ZnS 结构, 表面吸附三正辛基膦(PO (Oct 3 (in the figure , thesemiconductor nanocrystal is the core shell structure whose surface abs orbs trioctanal phosphine 。NH 22R :生物分子(biological m olecale , 其中R 可以是细胞(in which R may be cell 、生物素(biotin 、亲和素(avidin 、免疫球蛋白(IgG 、DNA 和RNA 等生物分子(etc. 。E DC :12ethyl 2332dimethylaminopropyl carbodiimide hydrochloride ,NHS (N 2hydroxysuccinimide :它们都是胺基和羧基反应形成酰胺的优良的缩合剂(they are all the g oodcatalyzers of the condensation reactions between amino and carboxyl for the formation of amides 。其二, 将半导体纳米晶体的表面包覆一层亲水层的无机物, 然后在表面修饰可与生物材料连接的官11342分析化学第30卷能团。Alivisatos 等将半导体纳米晶体的表面包上一层SiO 2后并用碱处理使半导体纳米晶体的表面带上羟基, 使半导体纳米晶体具有较好的水溶性; 然后用硅烷化试剂32氨基丙基三乙氧基硅烷处理半导体纳米晶体, 使其表面连接上氨基后再与生物素连接。利用生物素与链亲和素之间的特异性相互作用, 生物素标记的半导体纳米晶体特异性连接到链亲和素标记的鼠3T3肌动细丝蛋白上。对半导体纳米晶体表面不包覆直接进行修饰, 方法相对比较简单, 容易操作。而对半导体纳米晶体表面包覆一层物质, 发光强度往往会下降, 并且操作的难度较大。4. 3半导体纳米晶体标记蛋白质利用表面修饰后的半导体纳米晶体与生物材料之间的静电吸引作用可以实现对生物材料大肠杆菌麦芽糖结合蛋白的荧光标记-并可用作激光扫描成像、免疫分析的荧光探针, 是一种有效荧光示踪工29具。半导体纳米晶体与运铁蛋白通过酰胺键连接后, 后者仍能保持其生物活性, 可以通过HeLa 细胞的细胞膜特异性地被细胞内的受体所识别。与人的免疫球蛋白抗原相连后, 标记抗原可保持其生物特331,32性并可特异性地识别多克隆抗体。张春阳等, 用双光, 验证了天花33粉蛋白能以受体介导的内吞方式进入人绒癌细胞的机理、588和620nm 的4, 用来观(直径40nm 进行对比。, 。在同样的激发条件下, 前者比后者更亮, , 但是, 经过仅几分钟的连续照射, 会观察T M , 与有机荧光标记化合物Cy3和T M Cy5作了比较。半导体纳米晶体表面经过巯基琥珀酸处理与抗体连接, 可特异性地识别吸附在玻璃片上的抗原, 对抗原或抗体进行定性和半定量分析。在一块蛋白芯片(7525mm 上, 用半导体纳米晶体30可以同时进行两种抗体或抗原的检测。4. 4半导体纳米晶体标记DNA 分子修饰半导体纳米晶体与DNA 分子连接比修饰金纳米颗粒与DNA 分子连接困难得多, 由于柠檬酸-金颗粒之间的相互作用比较弱, 巯基化的DNA 分子可以很容易地取代金颗粒表面的柠檬酸使其固定到金颗粒的表面。DNA 是带有多个负电荷的亲水大分子, 而合成的半导体纳米晶体是亲油性的, 半导体纳米晶体与DNA 分子间的静电作用使得两者不可能连接。利用半导体晶体表面的原子如Zn 原子可28与巯基具有很强的络合作用, 可以将DNA 修饰上巯基再与纳米晶体进行连接。Mitchell 等将半导体纳米晶体表面修饰上巯基丙酸, 然后用末端带有巯基的DNA 分子部分取代巯基丙酸, 这样使DNA 就可以连接到半导体纳米晶体的表面。半导体纳米晶体修饰的DNA 分子, 可作为寡核苷酸的荧光探针, 特异性地与其互补配对的寡核苷酸杂交。标记半导体纳米晶体的DNA 分子与其互补配对的DNA 配对后纳米晶体的荧光光谱会发生变化, 半导体纳米晶体排列方式的改变是导致它们荧光变化的原因。有些34半导体纳米晶体的荧光特性对环境的变化很敏感,Mahtab 等利用半导体纳米晶体的这一特性来判定DNA 链是直的、弯曲的还是扭绞在一起的。随着DNA 分子非线性程度的增加, 半导体纳米晶体的荧光强度将不断减小。这样, 通过半导体纳米晶体荧光强度的变化可判定同属DNA 与蛋白之间的作用。35Han 等把可以发出不同光的半导体纳米晶体封装在一个聚合物微球中, 这样, 每个球中的荧光种类可以不同, 各种大小的半导体纳米晶体之间的数量比例也可以不同。用10种强度和6种颜色的纳米晶体理论上可以提供10万种不同的微球, 可为每种生物分子提供唯一的荧光信息。把DNA 序列连接到微球上, 根据微球中的半导体纳米晶体的种类和它们间的荧光强度的比例, 唯一确定是哪种DNA 序列, 其准确度可达到99. 99%。在一个聚合物微球上, 对DNA 的杂交研究时可以同时获得固定探针DNA 和游35离探针DNA 的荧光信息。5展望今后, 由于半导体纳米晶体吸引人的发光性质, 将会用于药物筛选、疾病筛查、基因测序等多个生命第9期 孙宝全等 : 半导体纳米晶体的光致发光特性及在生物材料荧光标记中的应用 11 35 科学研究领域 ,有望会给这些领域带来革命性的进步 。 36 37 生物芯片是目前的新兴领域 ,对芯片上生物材料的检测主要采用荧光标记检测 。将半导体纳 米晶体用于芯片上的生物标记后 ,由于发光强度增强 ,发射波峰尖锐 ,可改善芯片的灵敏度 ,有望会给生 物材料的检测带来突破性的进展 。对于一些背景荧光较强的芯片 ,由于半导体纳米晶体的发光时间较 长 ,可采用时间分辨荧光进行检测 。同时 ,采用非激光光源激发半导体纳米晶体就可获得足够的荧光强 度用来检测生物材料 ,降低了芯片的成本 。 References 1 Alivisatos A P. 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