细菌总数测定操作规程.doc

2012-XX-XX 定稿参照GB/T 13093-2006 饲料中细菌总数的测定。编制人审核人批准人细菌总数检测操作规程1 原理试样经过处理，稀释至适当浓度，在一定条件（如使用特定的培养基，在温度301培养72h3h等）下培养后，所得1g（mL）试样中所含细菌总数。2 试剂与仪器2.1 所用器具三角烧瓶、玻璃珠、具塞试管、培养皿、1000L枪头、5mL枪头、称量勺、接种环、接种针、移液器2.2 仪器：分析天平、恒温培养箱、微型振荡器、超净工作台、高压灭菌锅2.3 所用试剂和培养基营养琼脂取营养琼脂32.0g，加入蒸馏水1L，搅拌加热 至完全溶解，分装三角瓶，121高压灭菌15min，备用。3、操作步骤3.1 配制0.85%生理盐水。称取氯化钠8.5g溶于1000mL蒸馏水中。3.2 三角烧瓶加入生理盐水90mL和玻璃珠，试管中加入生理盐水9mL，121灭菌30min。（三角烧瓶个数与样品数量一致，试管数量与稀释次数相关）3.3 将1000L枪头、培养皿、5mL枪头、称量勺，121灭菌30min。（注意计算数量）3.4 将枪头、培养皿置于烘箱103烘干。（1-3步需提前一天完成）3.5对称量房间进行紫外灭菌30分钟，关灯静置60 min。以无菌操作取样品10g于含90mL生理盐水三角烧瓶中，于振荡器上振荡30min，制成1:10的均匀稀释液。3.6 用1000L枪头吸取1:10稀释液1mL，沿管壁慢慢注入含有灭菌生理盐水9mL的试管中，于振荡器上混合均匀，制成1:100的均匀稀释液。3.7 另去一只1mL灭菌吸管，按照上述操作方法，作10倍递增稀释，如此每递增稀释一次，即更换一支灭菌吸头。3.8 选择2个3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个培养皿。3.9 稀释液移入培养皿后，及时将凉至461的培养基（可放置461水浴锅内保温）注入培养皿约15mL，小心转动培养皿使试样与培养基充分混匀（从稀释试样到倾注培养时间不能超过30min）。如估计试样中所含微生物可能在培养基平皿表面生长时，待培养基完全凝固后，可在培养基表面倾注凉至461的水琼脂培养基4mL。3.10 待琼脂凝固后，倒置平皿于301恒温培养箱内培养72h3h取出，计算平板内细菌总数目，细菌总数乘以稀释倍数，即得每克试样所含细菌总数。4、细菌总数计算方法做平板菌落计数时，可用肉眼观察，如菌落形态较小可借助放大镜观察。在计算出各平板细菌总数后，求出同稀释度的两个平板菌落的平均值。4.1 细菌总数的报告形式细菌总数在100以内时，按其实有数报告，大于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法修约。为了缩短数字后面的零数，也可以用10的指数表示。（见表1）4.2 细菌总数计数的报告4.2.1 平板细菌总数的选择选择细菌总数在30-300之间的平板进行细菌总数测定，每一稀释度使用两个平板菌落的平均数。两个平板其中一个平板有较大片状菌落生长时不宜采用；若片状菌落不到平板的一半，而另一半菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全平皿细菌总数。4.2.2 稀释度的选择应选择平均细菌总数在30300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之（见表1中例次1）若有两个稀释度，其生长的细菌总数均在30300之间，则视两者之比如何来决定。若其比值（高稀释度数值：低稀释度数值）2，应报告其平均值；若2则报告其中较小的数字（见表1中例次2及例次3）。若所有稀释度的平均细菌总数均大于300，则应按稀释度最高的平均细菌总数乘以稀释倍数报告之（见表1中例次4）。若所有稀释度的平均细菌总数均小于30，则应按稀释度最低的平均细菌总数乘以稀释倍数报告之（见表1中例次5）。若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释度报告之（见表1中例次6）。若所有稀释度的平均细菌总数均不在30300之间，其中一部分300，或者小于30时，则以最接近30或300的平均细菌总数乘以稀释倍数报告之（见表1中例次7）。表1 稀释度选择及细菌总数报告方式例次稀释液及细菌总数稀释液之比稀释度选择细菌总数/CFU/g（mL）报告方式/CFU/g（mL）10-110-210-31多不可计16420取平均细菌总数在30300之间的稀释度1640016000/1.61042多不可计295461.630300之间，比值（46000：29500）2，报告平均值3775038000/3.81043多不可计271602.230300之间，比值（60000：27100）2，报告较小的数值2710027000/2.71044多不可计多不可计313所有稀释度的平均细菌总数均大于300，报告稀释度最高的数313000310000/3.1105527115所有稀释度的平均细菌总数均小于30，报告稀释度最低的数27