微丝染色及形态观察.ppt

目的要求 1 掌握微丝的染色方法 2 了解光镜下微丝的基本形态结构 3 了解细胞松弛素B对微丝的作用及原理 微丝染色及形态观察 实验原理 真核细胞质中纵横交错的纤维网称为细胞骨架 在维持细胞形状和运动方面具有重要作用 根据组成成分和组装结构的不同 可将细胞骨架分为微管 微丝和中间纤维 微丝普遍存在于多种细胞 对细胞的形状和运动有一定作用 微丝由蛋白单体聚合形成 细胞松驰素B可与微丝的亚单位肌动蛋白结合 从而破坏微丝 改变细胞的形状 细胞松弛素B对微丝的作用具有可逆性 当细胞用TritonX 100溶液处理 能够溶解质膜结构中及细胞内许多蛋白质 而细胞骨架中的蛋白质却不被破坏 经固定和考马斯亮蓝 非特异性蛋白质染料 染色后 胞质背景着色弱 微管等蛋白结构在光镜下无法分辨 在光镜下观察到主要是由微丝组成的应力纤维 应力纤维由平行排列的微丝组成 体外培养的贴壁细胞应力纤维尤为发达 形态长而直 常与细胞长轴平行并贯穿细胞全长 微丝在细胞内的分布特征 实验用品 器具 CO2恒温培养箱 倒置显微镜 超净工作台 低速离心机 普通光学显微镜 移液器 恒温箱 镊子 培养皿 载玻片 盖玻片 吸水纸 材料 盖玻片培养的成纤维细胞试剂 6mmol LPBS pH6 5 1 TritonX 100溶液 M 缓冲液 3 戊二醛固定液 0 2 考马斯亮蓝染液 100 g ml的细胞松弛素B DMEM培养液 实验步骤 1 培养在成纤维细胞进行传代培养时 将已消毒的盖玻片涂上多聚赖氨酸 放入培养皿中 于37 5 CO2的温箱中生长24h 48h 设正常生长组和细胞松弛素B处理组 2 染色处理 1 取材取出铺有细胞的盖玻片 放入小培养皿中 正面向上 用PBS洗3次 从盖玻片一角轻轻滴加3 4滴 洗去表面的培养液 2 抽提吸弃PBS 加入1 TritonX 100液4 5滴 刚好覆盖盖玻片表面 室温处理25 30min 或置37 18min 3 稳定吸弃TritonX 100 立即用M 缓冲液轻轻地洗涤3次 每次3min 4 固定略晾干 在3 戊二醛液中固定10min 再以PBS液洗3次 洗去固定液 5 染色滴加3 5滴0 2 考马斯亮兰染液染色20 30min 然后小心的用自来水漂洗 6 观察留取少量水分封片于载玻片 吸水纸吸去多余的水 光镜下观察临时装片 实验结果 光镜观察 微丝聚集成的应力纤维束被染成蓝色 在没用药的标本上 成纤维细胞多数有突起 微丝沿突起规则排列 用细胞松弛素B处理的标本 由于微丝被破坏 突起缩回 多数细胞形状变圆 用药处理后又洗去药的标本 由于解除了药的作用 肌动蛋白重新聚合成微丝 细胞形状恢复正常 1 光镜下观察被染成蓝色的微丝聚集成的应力纤维束 注意成纤维细胞中微丝分布的特点 2 注意观察正常对照片与用药处理后的标本成纤维细胞形状的区别 3 观察用药处理后又洗去药的标本中细胞形态是否恢复正常 光学显微镜下微丝分布图 注意事项 1 洗片时要轻柔 以免把细胞从载玻片上洗去 2 恢复时间要足够 否则细胞不会恢复到未处理前的状态 3 操作中应注意区分细胞盖玻片的正反面 4 染色后应冲洗盖玻片背面 避免损伤细胞 5 TritonX 100抽提蛋白时 注意避免抽提时间过长而导致细胞结构的破坏 作业与思考题 1 比较三种不