SDS-PAGE电泳分析表达蛋白.docx

试验三 SDS-PAGE电泳分析表达蛋白一、实验目的与要求1. 掌握SDS-PAGE电泳的操作步骤。2. 学会用电泳图分析原核表达效果二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂（SDS即十二烷基磺酸钠）后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小。三、实验材料与试剂诱导表达后的蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳试剂，蛋白上样缓冲液等。四、实验仪器设备伯乐蛋白电泳仪，细菌振荡培养箱、高压灭菌锅、电子天平，电炉，量筒等。五、实验步骤1、SDS-PAGE凝胶电泳试剂1）1.0 M Tris/HCl溶液（pH 6.8）：121 g Tris溶于900 mL蒸馏水，浓HCl调pH至6.8，定容至1 L；2）1.5 M Tris/HCl溶液（pH 8.8）：182 g Tris溶于900 mL蒸馏水，浓HCl调pH至8.8，定容至1 L；3）30 %丙烯酰胺溶液：292 g丙烯酰胺和8 g甲叉双丙烯酰胺溶于900 mL蒸馏水中，定容至1 L，4 避光贮存待用；4）5电泳缓冲液（pH 8.3）：94 g 甘氨酸和15.1 g Tris溶于800 mL蒸馏水中后，加入50 mL 10 % SDS溶液，定容至1 L，常温贮存，用时用蒸馏水稀释至1倍缓冲液；5）上样缓冲液：4 mL 10 % SDS溶液，0.2 mL巯基乙醇，1 mL 1.0 M Tris缓冲液，然后加入2 g甘油，20 mg溴酚蓝，充分溶解后定容到20 mL，4 贮存待用；6）染色液：1.0 g 考马斯亮蓝（R250），100 mL冰醋酸，450 mL 甲醇混合，定容至1 L，充分混匀备用；7）脱色液：乙酸100 mL，甲醇300 mL，加水定容到1 L；8）10 %过硫酸铵：0.1 g 过硫酸铵加入1 mL 蒸馏水充分溶解，需现配现用。2、SDS-PAGE凝胶电泳试剂1）利用12 %的分离胶进行SDS-PAGE进行电泳2）配制12 %的分离胶（10 mL）混匀，用注射器缓慢在两玻璃板之间加入分离胶溶液，留出浓缩胶的空间（与顶部距离约2.5 cm），以无水乙醇封胶，室温放置使其完全聚合（约30 min）。4）倒掉无水乙醇，超净工作台放置10-15 min，使其完全挥发；5）5 %浓缩胶配制（10 mL）混匀，用注射器缓慢在两玻璃板之间加入浓缩胶溶液至顶端，小心插入梳子，室温放置使其完全聚合（约30 min）。6）聚合完全后，轻轻拔出梳子，放入电泳设备，准备点样；7）点样：用点样10 L枪头进行点样，每次点20 L；8）电泳：额定电压80 V 30-60 min，待溴酚蓝条带离开浓缩胶时调整额定电压为120 V至电泳结束；9）染色及脱色：SDS-PAGE电泳结束后，小心取出凝胶，用去离子水清洗3-4遍，加入染色液染色2-3 h（30 r/min），倒掉染色液，用去离子水漂洗3-4遍，加入脱水液脱色6-8 h；10）成像：脱色结束后用Bio-rad成像系统成像拍照并保存图片。六、实验作业1、简述SDS-PAGE操作原理。 2、简述SDS