小鼠胰腺组织RNA提取过程总结.doc

RNA提取(人工方法)一 灭菌1.DEPC水 2.解剖器械 3.枪头 4.研钵 5.EP管 6.小烧杯 7.量筒 8.冻存管 9.小勺子 10.吸水纸 二 烘干4小时以上三 准备药品 1.50TAE buffer 2.无水酒精 3.氯仿 4.异丙醇 5.Trizol 6.液氮四 实验准备酒精倒入喷壶，喷洒桌面从烘箱中将烘干的灭菌物品拿到超净台将报纸平铺到解剖实验台将1.5ml EP管（取血用）放到管架上，拿出取血用小镊子 取鼠专用笼取实验鼠打开离心机，4制冷将1.5mlEP管中放入1mlTrizol（超净台中进行）五 提取RNA1. 取出研钵，冻存管，液氮预冷2. 小鼠眼球取血，解剖，取部分（20-30mg左右）胰腺及脾脏，迅速放入液氮中研磨，加入50ul 左右的trizol继续研磨成粉，剩下部分可放入灭菌的冻存管中冻存3. 小勺液氮预冷，将组织粉转入放有1ml trizol的EP管中剧烈震荡混匀，室温下放置约5分钟4 . 加入200ul氯仿，剧烈震荡混匀，室温2-3分钟，冰上15分钟5. 4C，12000g，10分钟（酒精泡电泳槽）6.取上清（300-350ul），移至EP管中，加入等体积异丙醇，柔振，放入-20C,15分钟7. 4C，12000g，10分钟（配电泳buffer）8.去上清，75%乙醇漂洗2次，7500g，5分钟（制胶）9.倒扣晾干，10分钟，DEPC水溶解RNA（约50ul）注意事项：* 胰腺内含有丰富的内源性RNA酶，取材时不要太大，磨成粉之后尽量快的用小勺转入EP管中六 RNA检测 1. 1ul上样缓冲液+1ul RNA+8ul DEPC水 2. 0.15g琼脂糖+15ml DEPC + 300ul 50*TAE 3.58.8ml DEPC +1.2ml 50*TAE 4.两条rRNA主带，大小分别是2kb和5kb，当5kb带的亮度大约是2kb带亮度的2倍时，RNA质量最好。小分子RNA带大约是0.1-0.3kb。七 反转录 1. 5ul DEPC . 1ul oligo（dT） . 6 ul分装 . 5 ul 总RNA 70C 5分钟 立即冰上 2. 5x ul 5*buffer 5x ul dNTP 1x ul M-MLVRT 2.37x ul DEPC 0.63 ul RNase1 14ul分装体系 42C 1小时RNA提取(试剂盒法)一 灭菌 （同上） 二 烘干4小时以上三 准备药品：1.50TAE buffer 2.无水酒精 3.氯仿 4.总RNA提取试剂盒 5.液氮四 实验准备酒精倒入喷壶，喷洒桌面从烘箱中将烘干的灭菌物品拿到超净台将报纸平铺到解剖实验台将1.5ml EP管（取血用）放到管架上，拿出取血用小镊子 取鼠专用笼取实验鼠打开离心机，4制冷将1.5mlEP管中放入1ml裂解液RZ（超净台中进行）五 提取RNA1. 取出研钵，冻存管，液氮预冷2. 小鼠眼球取血，解剖，取部分（20-30mg左右）胰腺，迅速放入液氮中研磨，加入500ul 左右的裂解液RZ继续研磨成粉，剩下部分可放入灭菌的冻存管中冻存3. 小勺液氮预冷，将组织粉转入放有1ml 裂解液RZ的EP管中剧烈震荡，室温下放置约5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离。4 . 4C，12000rpm，离心5分钟，取上清，转入一个新的无RNase的离心管。5. 加入200ul氯仿，剧烈震荡混匀，室温2-3分钟，冰上15分钟6. 4C，12000rpm离心10分钟。样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，水相的体积约为RZ试剂的一半，把水相转移到新管中。（酒精泡电泳槽）7.缓慢加入0.5倍体积的无水乙醇，混匀（此时可能会出现沉淀）。将得到溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，4C，12000rpm离心30秒，若一次不能将全部溶液和混合物加入吸附柱CR3中，请分两次转入吸附柱CR3中，4C，12000rpm离心30秒，弃掉收集管中的废液。8.向吸附柱CR3中加入500ul去蛋白液RD（使用前请先检查是否已加入乙醇），4C，12000rpm离心30秒，弃废液。（配电泳buffer）9. 向吸附柱CR3中加入700ul漂洗液RW（使用前请先检查是否已加入乙醇），室温静置2分钟，4C，12000rpm离心30秒，弃废液。10. 向吸附柱CR3中加入500ul漂洗液RW，室温静置2分钟，4C，12000rpm离心30秒，去除残余液体。（制胶）11.将吸附柱放入2ml收集管中，4C12000rpm离心2分钟，去除残余液体。后将吸附柱CR3置