蛋白含量测定及western步骤.doc

蛋白的提取和定量肺组织用预冷1TBS洗净后，加入含PMSF的RIPA buffer（冰上操作，310ul,决定未来的蛋白浓度和蛋白液体积）,50-60mg肺组织砸碎放入1.5ml离心管，冰上孵育1h，10000转4离心10min，转上清至新管。裂解液分装后保存于-70蛋白质定量：BCA蛋白测定法根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50：1）配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。完全溶解蛋白标准品(BCA试剂盒中，BSA原浓度2mg/mL),稀释到1mg/mL。将标准品按0，2，5，10，15，20，25 ul标准品孔中，加蒸馏水稀释标准品的溶液补足到25.1234567BCA( ul)2002002002002002002001mg/mLBSA02510152025ddH2O252320151050加样品2uL加到96孔板的样品孔中，加蒸馏水23微升。各孔加入200微升BCA工作液，37oC放置30分钟。同时打开酶标仪预热。注：也可以室温放置2小时，或60oC放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适量在较高温度孵育，或延长孵育时间。测定A570的波长，根据标准曲线计算出蛋白浓度。计算调蛋白时所需TBS和RSB的体积（调所有样品浓度至3-5ug/ul）：总体积=蛋白体积*蛋白浓度/3（ul）RSB=1/5*总体积（ul）TBS=总体积-RSB-蛋白体积（ul）先加RSB（对蛋白有保护作用），后加TBS。最后放于-70保存。Western BlotSDS-PAGE1. 玻璃板：注意对齐、夹紧，防止漏出，短板朝前。2. 按下表配制分离胶，浓缩胶。胶浓度ddH2O凝胶储备液Gel buffer10%SDS10%APSTEMED浓缩胶4%(5ml)3.05 ml0.65 ml1.25 ml50 ul25 ul10 ul分离胶10%（10ml）4.1 ml3.3 ml2.5 ml100 ul50 ul10 ul3. 灌胶：将配好的凝胶溶液沿玻璃板长面灌入，为方便可将玻璃板向后倾斜，灌至距绿线1cm左右，用dd水封顶，放置3040min。状况好时往往能观察到水与胶的界限。4. 分离胶凝固后，配制浓缩胶。将水倒掉，灌好浓缩胶，立刻插入梳子，等待40min。在此期间，打开水浴锅（100）注：此步后可停止，将胶连同梳子放入4保存一夜，若保存时间较长，为防止水分流失，可加盖湿润的滤纸和保鲜膜。5电泳前准备好：待测蛋白、Marker、1running buffer。蛋白在沸水中煮35min。（第二次后不用煮沸）6拔梳子，立即用1running buffer冲洗孔道（用塑料吸管）。7将玻璃板取出，固定于电泳槽（短面冲里相对），也要牢固，可先将电泳液倒入两玻璃板槽间观察是否渗漏。注：标记号1、2板及左右。8固定好后，加样。 跑道号码 加入物质及体积 1 3.5ul Marker (thermo #26616) 2-10 10ul Sample 9玻璃电泳槽倒满1running buffer，电泳液没过电泳槽中的钢丝即可，注意标记好带的顺序。10. 电极 黑对黑红对红，电压100V 电泳11.5h，等蓝色条带跑出后再等待1015min。蓝带对应8KD蛋白，根据蛋白样品分子量决定具体的电泳时间，确保不让目标蛋白抛出凝胶。一般可等蓝带完全跑出凝胶后10多分钟停止电泳。Western-ECL一、转膜1. 玻璃板取出，用跷胶片打开，标记好切胶位置，将浓缩胶和分离胶上的空白切掉。切胶时不要划，要切。注意，在右上角切口标记，量胶的长、宽。2. 将切好的胶（粘在一片玻璃板上）浸入Transbuffer，晃动使胶脱离下来，放上摇床，中速30min。3. 根据胶的长宽剪滤纸和PVDF膜（不能折，不能用手碰），PVDF膜的右上角与胶一样切口。滤纸不能太大，膜可以大一点。PVDF膜甲醇激活，transbuffer摇床10min。将滤纸浸入Transbuffer。（Transbuffer不倒掉）4. 转膜装置: 滤纸可以采用学校的大张滤纸剪裁，四层叠在一起使用 三明治由低层向高层为：四层滤纸膜胶四层滤纸，大小要一致 滤纸、膜、胶都需要用TRANS BUFFER浸透，上面滴加TRANS BUFFER 100伏转印60分钟。 如果转膜结束后不立即做，可以用TRANS BUFFER洗一洗，PBST洗一洗，晾干，保鲜膜包好后置四度保存。再用之前，甲醇激活，再用TRANS BUFFER洗一洗，PBST洗一洗。即可封闭二、杂交1. 将10*TBS稀释至1*（100ml1000ml），加入1ml Tween 20（0.1），即TBST。（Tween较粘稠，把枪头剪掉一块。）2配封闭液，脱脂奶粉5g，用量筒加100ml TBST，一般50ml足够（2.5g脱脂奶粉，TBST50ml。）3. 将PVDF膜用PBST洗一下，根据Marker分子量切带（在右上角切口标记,一定要在平的地方切）。* 若此时停止当日试验，可将NC膜放在保鲜膜上晾干，包好放入冰箱4。待使用时，用PBST洗一下，放入封闭液。4正面朝上放入脱脂奶粉中封闭1h，放在摇床上。配杂交液：用小瓶称0.2g BSA，用量筒加入PBST20ml。5杂交完毕后，用TBST略洗一下膜，加入杂交液将小条没过（3ml即可，可视情况而定）6加入一抗，摇床2h。过夜。7取出膜，用洗膜液洗3次，515min次。计算杂交液体积，若不足再配。8. 洗完三次膜加入二抗，摇床1h9. 用洗膜液洗3次，515min次。三、发光反应准备：发光板、滤纸、小镊子、1000l加样器、发光液1，2（按1：1的量混合先白瓶后黑瓶，混匀，注意换枪头）EP管。 显影：将洗完的PVDF膜放入PBST保持膜湿润，排好条带，记住顺序，用滤纸略吸水，放在发光板上，滴加显影液，用枪头滴在PVDF膜上，等2030s，发光。存盘。发光后，如要回收条带，收回后蒸馏水洗净，加入一抗二抗清除液，没过条带，摇床10min,蒸馏水漂洗5min,三次。洗净晾干回收。下次再用继续封闭。备注：1. 10TBS 0.2M Tris base (FW121.14) 12.114g1.5M Nacl (FW58.44) 43.83g H2O to 500ml PH=7.27.4 with HCLTBST 1 TWEEN20 TO 0.05 1L 100ml 10 and 500ul TWEEN202. RIPA buffer 100ml 可订购 Tris 0.607g 溶于90ml水，HCl调PH=7.5，补足到100ml NaCl 0.8766gNP40 1ml，脱氧胆酸 0.5g， SDS 0.1g，用时按1：1000加入PMSF每10ml放入一片PhosSTOP3. PMSF贮备液配置0.1M储存液，分子量174.190.0174g溶于为1ml无水乙醇（或异丙醇），-20摄氏度保存，用时1：1000稀释；4. 5*RSB 10ml PH=6.8Tris-HCl PH 6.8 0.312M/L 3.12mM*121.14=0.3779gTrisSDS 10% 1g-巯基乙醇 25% 2.5ml溴酚兰 0.25% 0.025g甘油 50% 5ml5. 凝胶储备液（30AcrBise）可订购 acrylamide(丙烯酰胺，有剧毒) 29gN,N-Methylenebisa-crylamide 1g，加ddH2O至100ml。6. Gel buffer 分离胶：1.5M TrisHCl PH: 8.8浓缩胶：0.5M TrisHCl PH: 6.8方法：按照Tris的摩尔质量计算所需摩尔浓度（Tris摩尔质量：121.14） 故分别称取Tris 18.171g、6.057g，加蒸馏水9095ml，然后用PH计调节溶液PH,最后定容至100ml。7. 10%SDS1g SDS加入蒸馏水10ml8. 10APS 0.1g过硫酸铵加ddH2O至1ml，新鲜配制9. 10*电泳缓冲液（running buffer） Tris 30.3g，甘氨酸 144g，SDS 10g，蒸馏水定容至1000ml。（PH = 8.3）10. Transbuffer: Tris 3.03g，甘氨酸 14.4g，加水至850ml，再加甲醇150ml11. 封闭液：脱脂奶粉5g，用量筒加100ml TBST，一般50ml足够（2.5g脱脂奶