研究生免疫组织化学染色技术.ppt

武汉大学病理教研室 免疫组织化学技术的定义 免疫组织化学技术 Immunohistochemistry IHC 是用标记的特异性抗体 或抗原 对组织内的抗原 或抗体 的分布进行定位 定性 定量检测 经过组织化学呈色反应在组织原位显示抗原 或抗体 如各种蛋白质 多肽 磷脂和多糖等成分的一门新技术 武汉大学病理教研室 免疫组织化学的应用 IHC通过检测细胞内 细胞表面或细胞间的正常或异常的物质 以研究组织细胞的正常生理 代谢及疾病的病因 发病机理 广泛用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的检测 细胞属性的判定 淋巴细胞的免疫表型分析 细胞增殖和凋亡的研究 以及细胞周期和信号转导的研究等 武汉大学病理教研室 实验名称 链霉菌亲和素 过氧化物酶连结法 Streptavidin PeroxidaseConjugatedMethod 简称S P法 检测胃癌组织CK Vimentin的蛋白表达 武汉大学病理教研室 S P法原理示意图 过氧化物酶 链酶亲和素 生物素 生物素化二抗 特异性一抗 待测抗原 武汉大学病理教研室 免疫组织化学基本实验流程 武汉大学病理教研室 具体步骤如下 1 石蜡切片二甲苯脱蜡 梯度酒精水化 以0 01MPBS pH7 4 漂洗3 5min 2 所有组织均采用微波修复抗原 3 室温冷却后 0 01MPBS pH7 4 漂洗3 5min 4 滴加50 l过氧化物酶阻断液 试剂A 37 湿盒孵育10min 5 0 01MPBS pH7 4 漂洗3 5min 6 滴加非免疫性动物血清 试剂B 37 湿盒孵育10min 武汉大学病理教研室 7 甩去多余血清 分别滴加 种抗体 4 湿盒孵育过夜 0 01MPBS pH7 4 漂洗3 5min 8 滴加生物素标记的二抗 试剂C 37 湿盒孵育15min 0 01MPBS pH7 4 漂洗3 5min 9 滴加链亲和素 过氧化物酶溶液 试剂D 37 湿盒孵育15min 0 01MPBS pH7 4 漂洗3 5min 10 每片滴加新鲜配制的二甲基联苯胺 DAB 显色液 光镜下控制反应时间 约为1 5min 自来水充分冲洗 苏木素复染 11 常规脱水 透明 中性树胶封片并镜检分析 12 阳性对照采用已知阳性片为标准 阴性对照采用PBS取代第一抗体 其余步骤相同 武汉大学病理教研室 实验流程中的注意事项 内源性过氧化物酶的灭活血清封闭冲洗抗体选择及一抗孵育时间检测及显色系统复染 武汉大学病理教研室 染色前处理 取材 脱水 浸蜡 组织及时固定固定剂选择 10 中性缓冲福尔马林4 多聚甲醛常规下固定8 24小时取材厚度 2mm 武汉大学病理教研室 染色前处理 预防脱片 常选用多聚耐氨酸 poly L lysine 注意 1 应严格控制使用次数2 玻片洁净度 武汉大学病理教研室 染色前处理 包埋与切片 包埋 选择低熔点石蜡 温度不超过62 切片 厚度3 4 m烤片 温度60 时间1小时 或60 2小时 迈新 或60 过夜 武汉大学病理教研室 染色前处理 切片保存 切片不宜长时间在常温下保存 武汉大学病理教研室 染色前处理 脱腊 原则 免疫组化的脱蜡试剂应与常规HE脱蜡分开 武汉大学病理教研室 实验操作中的应用 抗原修复实验操作中的注意事项 武汉大学病理教研室 抗原修复 影响染色结果的最关键因素抗原修复方法分类1 酶消化法2 加热法 高压法 水煮法 微波法 抗原修复液的选择1 柠檬酸盐缓冲液 PH7 2 7 4 2 Tris PH7 8 3 EDTA PH8 0 武汉大学病理教研室 内源性过氧化物酶的灭活 存在部位 红细胞 横纹肌细胞 粒细胞 单核细胞 肝细胞及肾细胞消除方法 3 H2O2浸泡10分钟 武汉大学病理教研室 血清封闭 目的 减少非特异性着色时间 一般在加载一抗之前使用 武汉大学病理教研室 冲洗 一般采用PBS PH7 4 7 6 充分冲洗增加效果可加入Tween20 武汉大学病理教研室 一抗孵育时间及抗体选择 应选择信誉高 质量好的试剂公司抗体切忌反复冻融一抗为浓缩液时 需选择最佳稀释浓度按说明书可采用37 1 2小时或4 冰箱过夜 武汉大学病理教研室 检测及显色系统 一般采用以生物素标记的辣根过氧化物酶为基础的检测方法 如SP LSABC ABC等显色方法 经常采用辣根过氧化物酶系统检测 武汉大学病理教研室 显色系统 常用的酶1 辣根过氧化物酶 HRP A 显色底物DAB 棕黄色敏感度高 定位清晰 易于观察 保存B 显色底物AEC 砖红色2 碱性磷酸酶 AP 显色底物 BCIP NBT 蓝紫色 武汉大学病理教研室 复染 原则 注意两者之间对比 突出阳性信号 武汉大学病理教研室 实验对照设计 原则 所有检测指标均设阳性对照 阴性对照 武汉大学病理教研室 结果分析 1 特定的定位胞膜型 胞浆型 全浆型或胞核型 局限性或弥散性 武汉大学病理教研室 免疫组化标准化照片 武汉大学病理教研室 2 染色的不均一性阳性切片的染色应分布不均 片状或点