线粒体COI基因克隆.doc

线粒体COI基因的分子克隆一、试剂材料1、500一800克重的活鲤鱼和1500一2500克重的活草鱼 各五条2、STE缓冲液(0.25mol/L蔗糖，10mmol/L TrisHCI，1mmol/L EDTA，pH8.0) 1L3、STM缓冲液(0.25mol/L蔗搪，10mM TrisHCl，0.5mmol/L Mgcl2，PH8.0) 50mL4、DNasel 2mg5、0.5mol/L EDTA pH8.0 10mL6、NTE缓冲液(20mmol/L NaCI，20mmol/L TrisHCI，lmmol/L EDTA，pH8.0) 50mL7、20% SDS 8、苯酚 50ml9、3mol/L NaAC (pH 4.8) 5mL10、冷乙醇(100%) 50mL11、95%乙醇 200Ml 12、TE缓冲液(10mmol/LTrisHcl，1mmol/LEDTA，pH80)， 10mL13、10mg/ml DNA一freeRNaseA溶液（溶解RNase A 于TE 缓冲液中，浓度为 10mg/mL，煮沸1030min, 除去DNase 活性，-20贮存） 40ul 14、氯仿:苯酚:异戊醇 (Vl:V2:V3为 24:24:l) 49ml(24+24+1) 1、引物1 、引物22、 10PCR 缓冲液（ Buffer ） 3、 2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 4、Taq酶5、琼脂糖：1.0%；6、电泳缓冲液（50 TAE 电泳缓冲液取Tris24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mol/L EDTA (pH8.0)20ml，加蒸馏水至100ml）7、溴化乙锭EB：5 l / 100 ml 8、溴酚蓝指示剂14、限制性内切酶BamH I、EcoR I、Hind II、Hind III和Pst l，16、氨苄青霉素(100ug/ml)的LB平板（胰蛋白胨10g ，酵母提取物5g，NaCl 10g ，加水 至1000ml , 若配置固体培养基，则再加入15gAgar(琼脂) 。）17、pUC19质粒DNA19、杆菌HB101菌株，20、感受态细胞HB101。二、工具材料1、剪刀 5把 不同大小2、镊子 5个 不同大小3、烧杯 2个大的 4个小的4、移液管 （一般用移液枪）5、离心管 10个最大的6、培养皿 5个小的 10个大的7、三角锥瓶 4个6、定容瓶 2个50 m L 1个1L7、试管架 1个三、设备材料1、高压灭菌锅 2、无菌操作台3、冰箱4、水浴锅5、离心机6、玻璃匀浆器7、凝胶电泳系统8、紫外透射检测仪9、PCR仪9、缺口转译标记试剂盒，10、质粒DNA限制酶消化分析及杂交探针系统11、硝酸纤维素滤膜13、同位素P32 标记的水稻线粒体Col探针 紫外透射检测仪四、实验步骤（一）鱼肝线粒体DNA 的分离与纯化1、按上面所写准备实验材料2、对实验器材灭菌3、对鱼预处理 刮鳞 消毒 取鱼肝用STE缓冲液清洗 4、再加入STE缓冲液到 玻璃匀浆器 里冰浴中缓和匀浆 5、离心 转头在3000g 离心 30分钟6、除去上层脂肪和管底细胞碎片 取上清液 继续离心 20000g 离心30分钟 得到粗提的线粒体沉淀。7、加入20ml STM缓冲液 2mgNasel 25水浴中保温消化30分钟8、取 0.8ml 0.5mol/L EDTA pH8.0 溶液加到消化液中，使终浓度为20mmol/L，终止酶解 反应。9、然后再加入160ml STE缓冲液，20000g下离心20分钟，收集线粒体沉淀，重复用STE缓冲液漂洗线粒体二次，清除污染的核DNA10、把离心所得的线粒体沉淀悬浮在20ml的NTE缓冲液，加入20% SDS溶液 至终浓度为0.8%，放置在37水浴中保温10分钟。11、用等体积的苯酚抽提脱蛋白二次，留水相，12、用10分之1的 3mol/L NaAC 和二倍体积的冷乙醇(100%)，混匀后放在一20冰箱中沉淀过夜。13、离心收集mtDNA，真空干燥后溶于2.0ml的TE缓冲液, 加入40ul(10mg/ml)的DNA一free RNaseA溶液 置37水浴中保温60分钟。14、消化液再用氯仿:苯酚:异戊醇 抽提2一3次。水相加乙醇沉.淀DNA，并将离心收集的mtDNA经真空干燥后，溶于适量的TE缓冲液中，贮于 20冰箱备用。（2） 线粒体CO I 基因的克隆1 PCR扩增（1）在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。10PCR buffer 5ldNTP mix（2mM ） 4l引物1（10pM） 2l引物2（10pM） 2lTaq酶（2U/l） 1lDNA模板（50ng-1g/l） 1l加ddH2O至 50l视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油（防止PCR过程中蒸发）。（2）调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93变性40s58退火30s72延伸60s，循环30-35次，最后在72保温710min。2、1%的琼脂糖凝胶电泳：（1）制胶（以60 mL为例） A、称取0.6 g琼脂糖，加入60 ml的TAE缓冲液（pH 8.0），摇匀； B、电炉加热，至琼脂糖完全溶解（要防止过热溢出三角瓶; 用东西盖上，防止挥发 ）； C、将制胶板放入制胶槽中，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖（约50）加入2ul EB后，混均匀，倒入其中，直至厚度为46 mm（如有气泡要把气泡赶出），在室温下冷却凝固(约30 45 min)； D、将制胶板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。（2）点样 (如在反应管中加有石蜡油，需用100L氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10l电泳检测) 用移液枪将5 l含溴酚蓝的扩增产物加入点样孔下部。（3）电泳 打开电源开关，调节电压至35V/cm(约100V)，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约30-40分钟后即可观察结果。（4）观察 将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计该样品DNA的浓度。如同时有已知分子量的标准DNA（mark）进行电泳，则可通过性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。3、 大肠杆菌感受态细胞HB101的制备及转化准备： 一. 材料 E. coli DH5菌株: R,M,Amp；pBS质粒DNA: 购买或实验室自制，eppendorf管。 二. 设备 恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光光度计,微量移液枪。 3. 试剂 1.LB固体和液体培养基 2.Amp母液 3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60左右,加 入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。 4.麦康凯培养基(Maconkey Agar):取52g麦康凯琼脂,加蒸馏水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高压灭菌，待冷至60左右加入Amp储存液使终浓度为50ug/ml,然后摇匀后涂板。 5、0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。 6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。 操作步骤： （1）受体菌的培养 从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37振荡培养2-3小时至OD600 0.5左右。 （2）感受态细胞的制备 ( CaCl2 法) A、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4下3000g（离心力）离心10分钟。 B、 弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4下3000g离心10分钟。 C、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。 D、 感受态细胞分装成200l的小份,贮存于-70可保存半年。 （3）转化 A、从-70冰箱中取200l感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。 B、 加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10l),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。 C、42水浴中热击90秒或37水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。 D、向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。 E、将上述菌液摇匀后取100l 涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37培养16-24小时。 同时做两个对照: 对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。 对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5l 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。 （4）计算转化率 统计每个培养皿中的菌落数。 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下： 转化子总数菌落数稀释倍数转化反应原液总体积涂板菌液体积 转化频率（转化子数每mg质粒DNA）转化子总数质粒DNA加入量(mg) 感受态细胞总数对照组2菌落数稀释倍数菌液总体积涂板菌液体积 感受态细胞转化效率转化子总数感受态细胞总数 注意 本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。但它们的转化效率并不一定一样。有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率。14、pUC19质粒DNA的制备 16、southern转移及杂交系统的制备 注意(A)加人适量的DNasel处理粗提的线粒体，以消除粘附在线粒体颗粒表面的核DNA;(B)用新鲜的而不是用冰冻的鱼肝组织提取mtDNA。因为我们在实验中注意到，用冰冻的肝组织往往得率低，而且核DNA的污染也更为严重，这可能同冰冻组织核膜容易破裂有关;(C)选用疏松的玻璃匀浆器取代电动高速匀浆器作缓和的匀浆，一般上下匀浆3一4次即可。如此操作既可使细胞膜破裂释放出线粒体颗粒，又可避免或减少细胞核膜的破裂。这样便很好地解决了核DNA的污染问题，得到了纯化的草鱼和鲤鱼mtDNA。纯化的mtDNA酶切效果好，经琼脂糖凝胶电泳后，DNA谱带清晰，明显无背景核DNA的污染。此外，按我们发展的程序纯化鱼肝组织的mtDNA，通常每100克鲜肝组织的得率可达30一50微克mtDNA，而且避免了氯化艳密度梯度离心法药品昂贵、设备复杂、实验周期长等多方面的缺点。 琼脂糖凝胶电泳的制备一、实验原理 溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5ng以上的DNA。1影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素： 1)DNA分子大小迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子大小相等，电荷基本相等（DNA结构重复性）。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快（超螺旋线性DNA） 2)琼脂糖浓度：不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNAAgarose：0.5%：1-30 kb；0.7%：0.8-12 kb1.2%：0.4-7 kb；1.5%：0.2-3 kb. 3)DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状线状DNA单链开环 4)所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm 5)碱基组成与温度：一般影响不大4 -30 6)嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率，(不提倡加在电泳液中) 7)电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1TAE，1TBE，1TPE（均含EDTA pH8.0）。2溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。3电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；二甲苯晴呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。4、电泳缓冲液：TAE TBETAE与TBE不同之处在于TBE用硼酸代替了TAE中的冰醋酸。 植物基因组DNA提取方法 植物基因组DNA的提取通常采用机械研磨的方法，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧 化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并可减少研磨过程中各种酶类的作用。 十 二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使 蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉 淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。 一.CTAB法CTAB(十 六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙 醇而除去。 1.试剂准备 (1)2CTAB抽提缓冲溶液: 100 mmol/L Tris-HCl （pH8.0），20 mmol/L EDTA-Na2，1.4mol/LNaCl，2% CTAB，使用前加入0.1%（V/V）的-巯基乙醇。 (2)TE 缓冲液：10mmol/L Tris-HCl, 1mM EDTA（ pH8.0）。 (3)DNase-free RNase A: 溶解RNase A 于TE 缓冲液中，浓度为10mg/mL，煮沸10 30min, 除去DNase 活性，-20贮存。 (4)氯仿-异戊醇混合液（24:1，V/V）：240mL 氯仿（A.R.）加10mL 异戊醇（A.R.）混匀。 (5)3mol/L 乙酸钠（NaAc，pH6.8）：称取NaAc3H2O 81.62g，用蒸馏水溶解，配制成200mL，用HAc 调pH 至6.5。 2. 实验步骤 (1)在2mL离心管中，加入500l的2CTAB和20 l -巯基乙醇, 65预热。 (2)称取新鲜叶片1-2g，用蒸馏水冲洗干净，再用无菌ddH2O冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到预热的离心管中，总体积达到1mL混匀后置65水浴中保温45-60min，并不时轻轻转动试管。 注：冻存材料直接研磨，绝对不能化冻。而且粉末应在化冻前转移否则内源性Dnase有可能降解基因组DNA。 (3)加入1/10体积的3mol/L的乙酸钠充分混匀，在冰浴中放置30 min中，4C 12000 rpm离心5 min，吸上清。注意，对于幼嫩叶片此步可以省略。对成熟的老叶片需采用。 (4)加等体积的氯仿/异戊醇（24：1），轻轻地颠倒混匀，室温下12 000rpm离心10 min。 (5)移上清至另一新管中，用氯仿/异戊醇重复抽提一次。 (6)移上清至另一新管中，向管中加入1/10体积的RNase A溶液，置37 20-30min。 (7)氯仿/异戊醇抽提后，加入2倍体积的100%乙醇或0.7倍体积异丙醇，会出现絮状沉淀，-20放置30 min，12 000rpm离心10-15min回收DNA沉淀。 (8)用70%乙醇清洗沉淀两次，吹干后溶于适量的灭菌TE缓冲液中。 (9)0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。用紫外分光光度计测定DNA浓度。 二.SDS法 SDS法的基本原理是研磨的组织细胞用热的SDS裂解后，加入高浓度的KAc，0放置以除去蛋白和多糖类杂质，最后用乙醇或异丙醇沉淀。 1.试剂准备 (1)提取缓冲液 Tris-HCl 100mmol/L（pH8.0） EDTA 50mmol/L （pH8.0） NaCl 500 mmol/L 灭菌后加-巯基乙醇至10 mmol/L (2)裂解液20%SDS (3)高盐溶液5mol/L KAc (4)RNaseA 10mg/ml 2.实验步骤 (1)取幼嫩的组织材料1-2g,用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌ddH2O冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到加有500L提取液的离心管中,轻轻混匀。 (2)向管中加入50L 20%SDS溶液，混匀，不可过于强烈震荡以防基因组DNA断裂 ，65保温10min，并不时摇动。 (3)加入150L 5mol/L KAc，混匀，置冰上20-30 min。 (4)4,15 000rpm离心15min,转移上清到另一离心管中，加入0.7倍体积的异丙醇，混匀，-20沉淀30 min 。 (5)12 000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀，吹干后加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。 (6)加入1/10体积的RNaseA，37保温20min，除去RNA。 (7)氯仿抽提后，加2倍体积乙醇，-20沉淀30 min 。12 000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀。 (8)用400L 70%乙醇洗两次后，吹干，加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。 (9)琼脂糖凝胶电泳检测完整性。用紫外分光光度计测定DNA浓度。 PHS3C型精密PH计安全操作规程一.PH计使用前准备的工作 1.使用PH计之前先用三蒸水清洗电极，注意玻璃电极不要碰碎。 2.准备在平台PH计的旁边放至调节用的NAOH液和HCL液。 3.在冰箱中拿出定PH液(PH=7.0),放与平台上。 4.打开PH计，调定PH值，按键选择PH和CAL选项，选择其中的CAL项，调节插入到PH液(PH=7.0)中，按键选择数据值到7.0处，出现小八叉即可。 5.将玻璃电极插入到待测的溶液中，再放入另一电极，适当的搅动液面（注意：不要碰碎玻璃电极）。 6.PH计的电子单元使用必须注意电路的保护，在不进行PH值测量时，要将PH计的输入短路，以避免PH计的损坏。 7.PH计的玻璃电极插座必须保持干净、清洁和干燥，不能接触盐雾和酸雾等有害气体，同时严禁玻璃电极插座上沾有任何的水溶液，以避免PH计高输入阻抗。 8.未到你需要的PH值时要小心的加如NAOH液和HCL液，（据调节范围不同可以选择不同浓度的调节液，浓度小时可以快加，浓度大时要加慢）。 9.加液时小心不要超过所需的定容量。二.PH计使用方法 1.后盖打开，装入电池一块。 2.装上复合玻璃电极注意：(1)复合电极下端是易碎玻璃泡，使用和存放时千万要注意，防止与其它物品相碰。 (2)复合电极内有KCl饱和溶液作为传导介质，如干涸结果测定不准必须随时观察有无液体，发现剩余很少量时到化验室灌注。(3)复合电极仪器接口决不允许有污染，包括有水珠。(4)复合电极连线不能强制性拉动，防止线路接头断裂。 3.打开电源开关后，再打到PH测量档。 4.用温度计测量PH6.86标准液的温度，然后将PH计温度补偿旋钮调到所测的温度值下。 5.将复合电极用去离子水冲洗干净，并用滤纸擦干。 6.将PH6.86标准溶液25ml倒入已用水洗净并擦干的塑料烧杯中，洗涤烧杯和复合电极后倒掉，再加入20mlPH6.86标准溶液于塑料烧杯中，将复合电极插入于溶液中，用仪器定位旋钮，调至读数6.86，直到稳定。应该注意以下两点：(1)必须用PH6.86标准调定位。(2)调完后，决不能再动定位旋钮。 7.将复合电极用去离子水洗净，用滤纸擦干，用温度计测量PH4.00溶液的温度，并将仪器温度补偿旋钮调到所测的温度值下。 8.将PH4.00标准溶液25ml倒入另一个塑料烧杯中，洗涤烧杯和复合电极后倒掉，再加入20mlPH4.00标准溶液，将复合电极插入溶液中，读数稳定后，用斜率旋钮调至PH4.00。应该注意斜率钮调完后，决不能再动。 9.用温度计测定待测液温度，并将仪器温度补偿调至所测温度。 10.将复合电极插入待测溶液中，读取PH值，即为待测液PH值。应该注意以下两点：(1)测定时温度不能过高