7.第七章_中医药研究中动物的选择和动物模型的应用.ppt

第七章中医药研究中实验动物的选择和动物模型的应用 内容提要 第一节中医药研究中开展动物实验的意义及优越性第二节中医药动物实验研究的主要内容第三节中医动物模型概述第四节中医动物模型的复制方法 第一节中医药研究中开展动物实验的意义及优越性 一 中医药研究中开展动物实验的意义二 中医药研究中开展动物实验的优越性三 中医药动物实验研究应注意问题 一 中医药研究中开展动物实验的意义 从中医药发展历史来看 中医药研究主要是通过长期临床观察的方法 不断认识和总结疾病的发生 发展 变化规律及有效的防治措施 这种局限于临床观察方法可能是中医药发展较缓慢的原因之一 随着现代科技的发展 中医药研究长期以来所形成的以经典校释 引证发挥 临床诊治观察为主的传统模式被打破 中医药研究的发展趋势出现了新的变化 动物实验研究成为重要的研究方法和手段 首先表现为高新技术如分子生物学 免疫学 遗传学 基因检测技术等的应用 其次是在临床治疗研究中 重视病证结合的研究 发挥中医诊断治疗的综合优势 使辩证辩病有机融合 优势互补 形成了现代临床中医辩证结合辩病治疗的优势 同时新理论 新观点 新概念不断出现和许多创新药物的开发 随着现代医学的迅猛发展 中医将动物实验手段从现代医学中移植过来 近几十年才逐渐发扬光大 将动物实验方法渗入到了中医生理 病理 方药 针灸 防治等研究领域 通过动物实验 提示了一些中医理论实质 为中医理论提供了一些实验科学依据 使动物实验方法在中医学研究中出现了新的苗头 表现了强大的生命力 总结近几十年中医动物实验研究概况 五六十年代多是通过动物实验研究针刺对疾病的防治作用 70年代多是通过动物实验进行中药药理研究 80年代则有通过动物实验 利用中医治疗手段对西药实验性病变进行防治 90年代以后利用现代医学技术和方法研究中医病证的分子机制等 虽然动物实验在中医药研究中的作用有目共睹 但仍有部分人由于受传统观念的束缚 不重视实验研究 这极不利于加快中医药的发展 实验中医现代化 促进中医走向世界 二 中医药研究中开展动物实验的优越性 在我国古代中医典籍中也有原始实验记载 如 黄帝内径 中讨论到脏腑志形态结构与功能 本草纲目 中记载运用动物进行原始实验等 国外最早有关动物实验可追溯到公元前4 3世纪古希腊哲学家和医学家亚里士多德对各种动物解剖的描述 正是前人通过大量实验研究 才推动医学乃至整个社会的快速发展 事实证明 中医药的发展 也离不开实验研究 中医药研究开展动物实验有非常重要的价值 主要表现以下几个方面 可以替代人体 预测中药毒副作用 可以严格控制实验条件 较可靠地证实治疗效果 可以验证和发展中医理论 为中医理论提供实验科学依据 可以缩短研究周期 加快中医发展 1 可以替代人体 预测中药毒副作用古今中外有关中药毒副作用的记载并不少见 如 淮南子 修务训 记载 神农尝百草之滋味 水泉之甘苦 全民知所避就 当此之时 一日而遇七十毒 备急千金要方 记载 水银中毒发生口舌糜烂 近年来报导 误服大青龙汤致死 误服大承气汤致死 日本医药品副作用文献抄录 报告 葛根汤 十味败毒散 八味地黄丸 柴胡加龙骨牡蛎汤 半夏泻心汤等36种方剂有副作用 还报导苍耳子中毒致死 乌头中毒致死等等 究竟有毒副作用的药物安全量是多大 中毒致死量是多少 服用后会出现哪些不良反应 哪些药物在什么情况下有毒副作用 以及发生毒副反应后如何救治 这些方面至今多还缺乏比较精确的认识 要解决这些问题 不可能也不允许在人体身上直接进行试验 因为医学的宗旨是为人类防病治病 增进健康的 所以最好的方法就是进行动物实验 2 可以严格控制实验条件 较可靠地证实治疗效果人类疾病的转归除药物治疗外还受着多种因素的影响 如 气候环境 精神情绪 饮食劳逸等 这些因素在一定条件下会造成疾病好转或恶化 临床上还可见到由于患者产生强烈的治愈要求 对接受治疗产生良好的疗效愿望 心理上产生一种有效偏因 从而出现治疗有效的反应 即所谓的 假阳性 现象 反之 临床上也常见到患者在治疗中因饮食起居不慎或受到精神刺激等因素的影响 从而造成疾病恶化 这些情况都会造成医生在治疗疾病中产生错误的疗效判断 之所以有些个案报道或新方疗效报道的疗效结果在临床上重复使用时出现与原报道结果不符的现象 其原因之一就与其它因素影响有关 所以要比较可靠地评论药物在治疗效果就需要在严格控制各种影响因素的条件下进行 但是由于人类的高度复杂性 在多数情况下很难严格控制 而对于动物来说就比较容易严格控制 3 可以验证和发展中医理论 为中医理论提供实验科学依据中医学产生于自然哲学时期 在其形成和发展过程中由于缺乏科学实验和其它科学手段 造成中医理论难以深入地提示更为具体的规律 出现一些笼统 抽象 模糊的概念 使丰富的实践经验与笼统 抽象 模糊的理论结合起来 动物实验可以使人的认识深入到直接观察难以达到的物质内部更深的层次 通过动物实验不仅可以为验证中医理论提供科学的实验依据 而且可以进一步发展中医理论提供科学的实验依据 如 为阐明 肺主通调水道 的理论 有人通过人工扩肺以增强免疫肺通气量观察对兔排出尿量的影响 发现当扩肺后动物尿量开始减少 伴随扩肺时间的延长 尿量减少越明显 停止扩肺后 尿量逐渐恢复到扩肺前水平 莫氏等在中医 肾开窍于耳 的理论基础上 用生物电作为内耳功能指标 证实了醛固酮对内耳功能有促进作用 由此提出把醛固酮作为联系中医肾与耳之间的物质基础的设想 等等 4 可以缩短研究周期 加快中医发展中医学的发展历史告诉我们 有此问题单凭临床经验积累需要花费很长时间才能得到解决 或者虽花费很长时间 问题仍得不到解决 而通过动物实验有些问题就可以得到迅速解决 如中药十八反中几对相反药 历来有人主张必须恪守 有人则认为不必绝对化 更有人认为合用显著的治疗效果 多少年来一直没有充分的依据来说明这一问题 有人通过动物实验仅在几个月内不仅证明了相反药配伍后毒性远比单味药高 而且证明了两种药物用量不同产生的毒性大小也不一样 等等 三 中医药动物实验研究应注意问题1 中医动物实验研究应以中医理论为指导中医动物实验研究应在中医理论的指导下进行 以中医的理 法 方 药贯串始终 无论是基础医学还是临床医学研究均应遵循这一原则 要以中医的整体观念为指导 按中医理论严格辨证 包括辨病与辨证结合 以中医学的治疗原则和治疗方法为主进行治疗 处理 2 中医动物实验研究应从中医临床出发医学研究的最终目的是防病治病 增强体质 动物实验的目的是为了了解和防治人类疾病 这一点在中医动物实验研究中尤其突出 因为中医学与现代医学有所不同 她直接来自临床实践 其理论主要是建立在临床实践基础上的 并由此形成了中医学的学术体系 临床医学既是中医学的基础 又是中医学的精华 其中蕴藏着学术价值极高的科研素材 对中医基础理论的研究往往也是从临床入手 3 中医动物实验研究应突出中医治疗原则随着中医学学术发展的日渐深入 越来越多的动物实验被运用到中医学的治疗原则 治疗方法和中药的研究中 这也是中医学动物实验研究的一个重要内容 中医动物实验研究中的治疗应遵循中医学治疗原则 主要采用中医中药 针灸 推拿 气功等中医传统治疗方法 包括配合西医学疗法 4 利用西医动物模型问题中医动物模型有其独特性 能真正反映中医 证 的特点的动物模型 就是较为成功的动物模型 中医动物模型的复制应以中医理论为依据 体现中医特色 不能单纯把西医疾病模型当成中医证的模型 中医的证候不完全等同于西医疾病的症状 临床上常可以看到同一种西医疾病 中医可能诊断为多种证候 而对不同的西医疾病 中医也可能诊治方法完全相同 所以要研究中医 发展中医 不能完全照搬西医动物模型 应根据中医特点 复制体现中医药特色的动物模型 但这并不排除运用西医现代科学技术对中医药进行深入细致的研究 5 中医动物实验设计问题中医研究中动物实验设计应考虑到人与动物的差异问题 人与动物的生命现象 其基本的生命过程 有一定的共性 这是医学实验中可以应用动物实验的基础 但另一方面 不同种属的动物 在解剖 生理特征 病理特点和对各种因素的反应上 又各有其个性 例如不同种属动物对同一致病因素的易感性不同 甚至对一种动物是致命的物质 对另一种动物可能完全无害 动物的疾病模型和人类的对应病证 虽有相似之处 但不一定完全相同 另一方面由于在动物实验中往往仅改变一个条件 而使其他因素保持不变 而人体的许多生理过程是同时受多种因素影响的 显然在比较简单的条件下 得出的结论 可能就不一定完全适用于较复杂的人体情况 第二节中医药动物实验研究的主要内容 模型动物的开创和发展 以动物实验验证临床治疗方法 中医基础理论研究及应用 其他研究及应用 中医学主要通过临床研究方法 来认识疾病的发生 发展 变化的规律及总结有效的防治措施 这样的研究方式已远远满足不了当今人类的卫生保健事业对中医学日益增长的需要 由于临床观察周期长 干扰因素多 导致研究费时费力 且难以深入 限制了中医学的发展 因此 推广动物实验研究 能极大地推动和加速验证及发展中医理论 探索中药的药理 毒理作用等 为中医临床提供现代科学依据 进而为中医学新理论的形成奠定基础 近几十年来的中医动物实验研究包括以下主要内容 一 模型动物的开创和发展 自20世纪60年代以来 在中医证的动物模型制作与研究方面做了大量的研究工作 迄今证的动物模型逾150多种 其中包括各种虚证 阴虚 阳虚 气虚 血虚 各脏腑虚 血瘀证 肝郁证 寒证 热证 温病卫气营血诸证 里实证等模型 实验动物疾病模型应用于中医临床研究 为中医诊疗方法研究提供了大量的实验模型 为临床理论的深化与新理论的形成提供了便利 以脾虚证动物模型研究为例 脾虚证动物模型的造模方法有服用苦寒中药 如大黄 番泻叶 饮食不节 饥饿 偏食 过食等 过劳以及综合方法 其模型动物皆有畏寒 腹泻 脱肛 食欲减退 懒动 体重下降等脾虚证的临床表现 脾虚动物模型的大量研究资料表明 脾虚证动物体内结构 功能 代谢的变化 以消化系统损害为主 以胃肠屏障作用和胃肠细胞损害为病理基础 以小肠吸收功能障碍为病变核心 并累及免疫 内分泌 生殖等多系统 多器官 脾不统血证 则是在脾虚证病理变化的基础上出现的血液循环与血凝障碍 其中 唾液淀粉酶活力减低 木糖排泄率下降被公认为脾虚证特异性高 重复性好的客观指标 二 以动物实验验证临床治疗方法 探求其作用机制中医药学数千年来防治疾病的经验中蕴藏着学术价值极高的科研素材 历代医家反复运用 不断总结 提高 形成了中医学独特的理 法 方 药体系 其卓越的治疗效果举世公认 迄今为止 中医临床实验研究已经积累了相当的资料 这些研究工作对于指导临床疾病的防治 乃至中医理论的发展都起了重要作用 中医临床实验研究的任务之一是用现代研究手段来验证和发展临床治疗方法 探求其作用机制 中医学在长期的医疗实践中 形成了许多卓有成效的治疗法则 如清热解毒 扶正固本 活血化瘀 软坚散结 通里攻下等 具体运用时又有针对某一脏腑的阴阳偏盛或偏衰 气血盈亏 寒热失调等的具体疗法 然而这些治则治法作用于机体的哪些器官 组织 细胞或其中的哪种结构或物质 其作用方式和机制是什么 等等 回答这些问题必须借助于动物实验 临床治疗方法的动物实验研究主要包括以下几方面 1 研究经方的作用机制中医古典医籍汗牛充栋 其中防治疾病的法则不胜枚举 绝大部分至今仍在沿用 通过现代科学方法对其进行系统的动物实验 为临床治疗提供了有价值的依据 例如 姜廷良对 伤寒论 名方桂枝汤治疗发热的动物实验结果显示 桂枝汤可通过不同途径 在发热产生的不同环节调节体温 解除发热 其作用在不同致热源作用于机体所引起的发热中均可观察到 金元时期名方益气聪明汤原为治疗 上气不足 的方剂 经名老中医金寿山加减运用治疗脑动脉硬化所致供血不足的头晕 头昏眼花 耳鸣 记忆力减退等症状疗效显著 吴敦序 张煜等对该方作了一系列动物实验 表明该方可以提高脑对缺氧的耐受性 改善脑血液循环和脑供血量 降低血脂 增强大鼠学习与记忆的能力 蒋莹 许继平等对 伤寒论 名方六味地黄丸的动物实验研究表明 该方口服液 由丸剂改制 对四氯化碳 CCl4 和硫代乙酰胺 TAA 引起的小鼠肝损伤有保护作用 对老龄小鼠血清脂质过氧化物 LPO 和肝脏脂褐质 LPF 含量均有降低作用 可明显减少缺血心肌中丙二醛 MDA 含量 提高超氧化物歧化酶 SOD 活性 缩小梗死面积 改善梗死区边缘的扩大 保护心肌 该方还可扩张外周血管 降低高血压大鼠的血压 又可显著对抗高脂饲料引起的大鼠血清总胆固醇 TC 的升高和高密度脂蛋白胆固醇 HDL C 的降低 使血清TC HDL C和HDL C TC比值保持正常水平 同时还可明显降低高脂饲料引起的大鼠肝中脂肪含量的升高作用 该方的临床和动物实验研究还显示其与抗肿瘤化疗药物同用 具有明显的减轻化疗药物所致的毒副反应症状 血红蛋白 白细胞 血小板含量在化疗后仍能维持在治疗前水平 同时对NK细胞活性 T淋巴细胞转化 T细胞亚群 醋酸萘乙酯酶有较好的保护与调节作用 对心 肝 肾等脏器功能有减除损伤现象 2 研究名老中医经验疗法的作用机制除了古代医家典籍之外 当代名老中医的临床经验亦是一笔无价之宝 当代中医药界名家荟萃 有丰富的临床治疗经验 医术精湛 学术造诣高深 新中国成立之后 还涌现了一批学贯中西的专家 现代科学的研究方法包括动物实验已被广泛应用于他们的工作中 如张伯讷教授在50年代创制的治疗更年期综合征的经验方二仙汤 经40余年的临床应用 疗效肯定 得到普遍推广和国内中医界的公认 方肇勤等经系统的动物实验研究表明 二仙汤煎剂有明显延缓发情休息早期 20月龄 大鼠下丘脑 垂体 性腺轴的衰老 改善其促性腺激素释放激素 促性腺激素和性激素的合成与分泌 提高血浆性激素的水平和改善雌二醇 睾酮 E2 T 值的老年性变化 并能增进老年大鼠性激素效应器官中性激素受体复合物的核向迁移率 还可升高雌性去势大鼠血浆E 的含量 促进去势雌雄大鼠肾上腺网状带增生 以促进性激素的合成 等等 上述作用可能即是二仙汤治疗更年期综合征有效的部分机制所在 最近他们的研究还表明 二仙汤及其拆方可调节老龄 24月龄 大鼠下丘脑促性腺激素释放激素 GnRH 基因的转录与表达 有提高雌 雄老年大鼠下丘脑GnRH基因的转录水平 提高腺垂体GnRH的单位含量的作用 提示该方治疗更年期综合征取效的部分机制与该方延缓下丘脑衰老 提高其GnRH的转录与表达水平有关 二仙汤还具有增强老年大鼠SOD活性与降低血浆及组织中LP0 LPF的含量 提高老年大鼠淋巴细胞转化率和淋巴细胞体外存活率 增加其胸腺内T淋巴细胞的数量的作用 张煜等的研究表明 名老中医董廷瑶治疗婴幼儿吐乳的经验疗法 按压舌根部 火丁 遏制小儿吐乳 经动物实验研究证实其作用机制是通过按压舌根部强化胃的容受性舒张反射 使胃容积加大 胃内压力减低 从而有效地遏制胃内容物的返流 这些动物实验结果为临床实践提供了科学的 客观的实验依据 并对临床用药起了指导作用 3 应用于新药开发 中医药学研究的重要任务之一是寻找更多的有较好疗效的新药 目前许多疾病 包括多种慢性疾病 死亡率极高的癌症 心脑血管疾病 艾滋病等均缺乏疗效好 毒副反应小的药物治疗 现在临床上常用的西药多为化学制剂 普遍存在各种毒副反应 尤其不宜长期服用 中药虽有毒副反应小的优点 却往往缺乏较强的针对性和较显著的疗效 因此 积极寻找 试制理想药物是当代医学科学研究的重大课题 而所有新药都必须经过严格的系统的动物实验 详细了解其代谢特点 药理作用及有何毒副反应等 才可应用于人体 近年来中药新药的开发已取得了长足进展 如国家 八五 科技攻关课题 国家级最新抗肝炎药物肝达康片的研制 即根据名老中医谭日强教授治疗慢性肝炎的有效经验方 经临床观察和动物实验进行 谭日强等的实验研究结果显示该药对CCl4肝损害大鼠的血清丙氨酸转氨酶 ALT 的升高可明显降低 p 0 05 对CCl4损害小鼠产生的P 450水平有提高作用 P 0 05 能明显抑制雏鸭乙肝病毒DNA 提示有抗乙肝病毒作用 对氢化可的松引起小鼠肝细胞核仁减少有明显增大作用 P 0 01 和核仁数目增加作用 提示有促进肝细胞恢复 增强肝细胞蛋白代谢的作用 毒性试验 各项指标均显示肝达康片无毒性 服用安全 三 中医基础理论的研究及其在教学上的应用60年代初期邝 音 矿 安堃 音 坤 首创 肾阳虚 动物模型即是用于研究中医基础理论的 借助实验动物 包括动物实验 研究中医基础理论 是中医理论和实践发展史上的一次革命 一次飞跃 经几十年工作的积累 在中医基础理论阴阳 气血 藏象 病因病机学说方面都有了可观的进展 对于探索上述学说本质 揭开中医学的奥秘 使之用现代的科学语言进行表述 研究生命及其调控现象及机制 均起到了积极的作用 本教材的其他章节还会大量地引用和介绍 可以参阅 自80年代初上海中医药大学首次将动物实验引入中医基础理论教学以来 动物实验已成了中医基础理论教学的重要手段和组成部分 动物实验在中医研究中已渗入到各个领域 除以上所介绍的外 较多的应用领域有中药药理 包括性味归经 的实验研究 中草药毒理的动物实验 各类常用中草药有效成分的药理 毒理和代谢 中草药原料开发 保健品和化妆品等的开发 以及对其安全性评价等 四 其他研究与应用 第三节中医动物模型概述 一 中医动物模型的发展二 复制中医动物模型的基本要求三 中医动物模型复制的原则四 中医动物模型存在的问题 一 中医动物模型的发展 国内早在1960年邝氏等就指出皮质素型动物 即醋酸氢化考的松模型 氨考模型或 阳虚 模型 一系列病态与阳虚临床特征基本符合 1963年邝氏等又观察发现 助阳药能减轻或纠正过量皮质素引起的动物耗竭现象 并对助阳药作用机理进行探讨 认为助阳药的作用并非单纯促进蛋白质合成或补充了钾或者替代肾上腺皮质激素 其确切作用机理是否是纠正了机体 阳虚 本质难以肯定尚待探讨 1964年上海第二医学院附属广慈医院舌研究小组 为开展气 阴虚舌象的动物实验研究 以人工慢性贫血及高位小肠侧瘘 造成 气虚 和 阴虚 模型 1977年上海中医学院正常人体学教研组 认为助阳及滋阴药能调节 阳虚 及 阴虚 现象 可反证造型的属性 1980年施氏等首先采用电镜技术观察某些助阳药对 阳虚 模型的肝细胞亚微结构的作用 发现助阳药能调节细胞核DNA复制及RNA 蛋白质合成 改善细胞能量代谢 同年 北京师范大学生物系消化生理科研组在国内首先报道用中药大黄水浸煎剂造成 脾虚 模型 并用四君子汤反证 1981年陕西中医学院生理教研室用改变植物神经系统机能状态的药物建立类似 阳证 阿托品 及 阴症 利血平 模型 并设想临床 阳症 和 阴证 的产生与交感 副交感神经系统机能的盛 衰有关 同年 贲氏等以皮下注射乙酰苯肼 APH 造成实验性溶血性贫血 拟 血虚 模型 同年 施氏等认为 阳虚 模型 早期以 阴虚 为主 滋阴药有一定作用 后期才以 阳虚 为主 助阳药对之有显著作用 说明中医阴阳贯穿整个疾病过程 1982年施氏等又发现某些助阳药对 阳虚 动物脾脏淋巴细胞有显著保护作用 严氏等对 脾虚 动物的体表冷光 温度及皮肤电阻 体重等多种体表物理信息的研究 发现体表冷光变化幅度最大 其次是体表温度 体重 而体表电阻较差 并认为这些指标有方便 快速无损等优点 是可取的 南京医学院中西结合研究组 开展了脾虚泄泻证的动物模型研究 认为番泻叶与大黄致泻理作用基本一致 但其用量为大黄的1 10 主张番泻叶可作为复制脾虚泄泻证动物模型的首选药物 张氏等认为助阳药能提高 阳虚 动物DNA合成率 降低死亡率 史氏等于家兔耳缘静脉注入10 高分子右旋糖酐造成 血瘀 动物模型 并观察川芎注射液治疗作用 梁氏等用三联疫苗及寒凉药造成寒证 以温热药造成热证模型 观察电刺激效应 夏氏等模拟几种常见的虚证病人 用不同方法同时建立四种 互相对立的两组 病理模型 即甲状腺功能亢进 甲亢组 及减退 甲减组 糖皮质激素过多 氨考 组 及肾上腺皮质抑制 氨考 组 等四组 然后用滋阴药 生地 龟板 和助阳药 附子 肉桂 进行反证 即 诊断性治疗 区分证型 结果 甲亢组和氢考 组服用滋阴药有效 用助阳药反恶化 辩证为阴虚为主 甲减组及氨考 组服用助阳药有改善 用滋阴药恶化 故属阳虚为主 上述情况与临床所见基本一致 另外 两组模型血浆中环核苷酸含量的变化与临床结果亦一致 本实验在方法学上进行了一些改进 采用了先注射 肾上腺素激动剂 异丙基肾上腺素 或M 胆碱能激动剂 氨甲酰胆碱 引起血浆中cAMP和cGMP大幅度升高 然后取血测定cAMP cGMP含量 且观察cAMP cGMP系统对相应受体激动剂刺激的反应强度 从而 不仅相对提高了测定方法的灵敏度 且比单纯测定血浆中环核苷酸的含量 获得更多的信息 1983年徐氏等观察 阳虚 动物牙周变化及助阳药作用 耿氏等观察了助药对 阳虚 模型免疫功能影响 熊氏等以大肠杆菌注入兔耳缘静脉复制温病卫 气 营血模型 胡 关氏等观察大黄致虚模型的形态及免疫功能变化 黄氏等报道用100 的大黄 甘遂 大戟 芫花煎剂及100 的甘遂合剂 甘遂 芫花 大戟 喂饲小鼠未形成脾虚模型 而采用甘兰加猪脂喂饲小鼠则成功 施氏等观察到右归丸 温肾阳 补精血方剂 对 阳虚 动物肝细胞核亚微结构有保护作用 杨氏等用外源性糖皮质激素地塞米松灌胃造成下丘脑 垂体 肾上腺皮质 HPA 轴受抑模型 1984年马氏等观察到补骨脂注射剂能减轻因大剂量醋酸氢化考的松对肝细胞的损伤作用及使受氢考影响而下降的酶反应上升 李氏等以反映上皮细胞葡萄糖转运系统各种性能的葡萄糖转运电位 PD 为指标 观察脾虚动物离体小肠不同环境下PD受抑 四君子汤有促进恢复的作用 另外 汪氏等还发现小鼠氨考模型的腹膜细胞总数显著减少 中药 附子 肉桂 仙灵脾等 对其有调节保护作用 等等 二 复制中医动物模型的基本要求 1 符合中医的理论特点中医学具有完整的独特的理论体系 中医实验研究必须以中医学的基本理论为指导 应用现代科学实验方法 使古老的中医理论在实验中得以阐明 因此在实验动物模型制作方面 以中医病因学说为指导 采用气温变化 饮食失宜 过服中药及手术结扎等造型法 所做出的动物模型表现的证基本符合中医临床实际 能较好地反映中医病因病机理论的重点 而目前 阴虚内热 模型的制作 多采用给动物服用激素 肾上腺皮质激素 甲状腺素等 或温热中药 如附子 肉桂等 的方法 这些阴虚模型虽然可出现类似于 阴虚证 的表现 但中医界不少人认为这种造模方法不甚符合中医病证的病因病机理论 而是药物副作用或毒性反应的结果 根据中医病因学说 用给小鼠喂养辛温燥热食物的方法 制造出 虚热 的动物模型可以较直观地显示饮食偏嗜致病的病理变化过程 2 重复性好复制方法可靠 动物模型能重复再现3 简便易行造模方法操作简单 成功率高 便于推广应用4 观察指标具有直观性与客观性动物模型的观测指标力求客观性 直观性及重复性 既能如实反映实验所提问题的特征变化 又便于操作 如把小鼠的体温 心率 活动度 精神表现 眼球的凹凸 耳廓色泽 游泳时间作为 阳证 阴证 的观测指标 两者呈鲜明的对比 形象地显示了 阳 与 阴 的特征 5 造模时间短实验设计力求以急性实验为主 如阿托品 利血平致阳证 阴证模型造模时间常需数天 而采用大剂量给药方法 30分钟就能看到实验结果 寒邪致病及热邪致病模型也能在一小时内完成 三 中医动物模型复制的原则 动物模型的复制是现代医学研究的基本方法 西医动物实验有急性动物实验和慢性动物实验之分 其应用方面包括实验生理学 实验病理学和实验治疗学等 在中医药研究中应用较多的是慢性动物实验方法 即复制成各种动物疾病模型 观察疾病发生发展的规律 研究各种实验性治疗措施的效果 进而探讨中医药学理论的现代科学基础 利用中医药动物模型开展实验研究是多学科 多领域的工作 在复制动物模型中涉及现代医学基础各学科 但其研究的目标是明确的 即发展中医药科学 所以在具体做法上我们必须遵循以中医理论为基础 强调以传统的中医理论体系为核心 按中医学自身的发展规律研究中医药学 发展中医药学 辨证论治是中医学的基本特点之一 这里的 证 包括病变部位 原因 性质和邪正斗争等各方面的情况 与西医的症状不同 中医的证更全面 深刻 正确地反映疾病所处的状态和本质 证是中医理论的核心与精华 中医诊断从辨证入手 治疗又以辨证为依据 证定则治法定即辨证论治 这是中医的特色 所以在中医药研究中 对证加以深人系统的研究是促进中医药学术发展的关键 从证入手 复制证的动物模型 用于临床疗效和基础理论研究 才能保留中医精华 不失中医本色 在具体做法上 复制中医证的模型时要注意与西医所应用的病的模型相区别 中医药研究中应用动物模型是受西医模型的启发 因而初期阶段引入了西医应用的模型 西医动物模型多是在特定的机械 物理 化学或生物的致病因素作用下形成的类似某西医病的发生发展的病理过程 其在造模时重视动物组织 器官或全身的病理损害 造模标准是类似所研究的人类疾病过程中形态结构 功能状态和代谢方面的变化 反映西医病的体质和发病机理 一 根据辨证论治理论复制动物模型 中医的证则是一个综合症状和体征 可以包括病理改变类似的多种疾病不同时期的临床表现 因此中医的证可能是引起某些相应变化的不同疾病的共同表现 即西医不同的病可能属于中医相同的证 西医相同的病在不同发展阶段也可能属于中医不同的证 我们必须以中医辨证论治为基础 以复制中医证的模型为目标 根据中医八纲辨证理论 中医的证可分为阴 阳 表 里 寒 热 虚 实八类证候 在造模时应以此为基础 根据研究目的复制各证的模型 如阳虚证 阴虚证 寒证 热证等 无论造成何种病理模型 其表现和体证与中医证的临床表现大体一致 能真正反映中医证的特点 就是较是较为成功的 如用寒凉药复制寒证模型 温热药复制热证模型 用多种方法复制的用于阴阳本质研究的阴虚证动物模型和阳虚证动物模型等等 中医脏腑学说是研究人体各脏腑 组织 器官的生理功能 病理变化及其相互关系的学说 是中医学理论体系的重要组成部分 因为中医脏腑不单纯是一个解剖学概念 更重要的是生理病理方面的概念 所以中医脏腑学说中一些脏腑虽与西医器官名称相同 但生理病理的含义却不完全一致 一个中医腑腑的功能可能包括多个西医器官的功能 一个西医器官的功能也可能分散在几个中医脏腑功能中 如中医的心的功能包括了现代医学心血管系统 大脑及部分自主神经的功能 中医的肝虽与现代医学在解剖学上相符合 但功能上是以现代医学的消化系统 神经系统为主 尚包括内分泌系统 血液循环系统 免疫系统和物质代谢的功能 中医的脾在解剖学上应包括现代医学的脾和胰 而功能上则概括了消化 神经 内分泌 血液等系统 所以中医的脾是以消化系统为主的多系统 多器官的功能单位 二 根据脏腑理论复制动物模型 中医肾的功能除包括现代医学的泌尿生殖系统外 还有部分神经内分泌功能 尤其是下丘脑 垂体 肾上腺皮质系统的功能 因为中医脏腑含义和西医相应器官的差别 所以中医研究中不能直接利用西医实验中相应各器官的动物模型 而应采用一定方法复制符合中医脏腑概念的动物模型 如脾脏证实质的研究中 从中医脾主运化的功能入手 复制反映脾脏功能不足而表现出类似临床脾虚证的动物模型 利用中药大黄性苦寒 归脾 胃 大肠经的特点 过量长期服用 损伤脾脏 脾的运化水谷精微功能减退 脾失健运不能升清而出现类似脾虚证临床表现的动物模型 符合脾虚证临床出现腹胀 便溏 食欲不振 神疲乏力 肌肉瘦削 软弱无力等表现 这是用西医脾的功能无法解释的 又如在中医肾的实验研究中发现与下丘脑 垂体 肾上腺皮质系统功能紊乱有关 甩糖皮质激素复制肾阴虚证和肾阳虚证动物模型 经滋阴药与助阳药验证符合中医肾脏证的特点 这也是西医肾的功能无法解释的 在实际复制的动物模型中 一定要注意脏腑定位 要使脏腑的含义符合中医脏腑的概念 病因是破坏机体相对平衡状态而引起疾病的原因 中医学认为导致疾病的原因是多种多样的 如六淫 七情以及饮食 劳逸等 在一定条件下都能使人发生疾病 中医学将病因归纳为 三因 三因学说把致病因素和发病途径结合起来为辨证施治提供了依据 中医辨证时将致病因素的客观条件与病证的临床表现结合起来 通过分析疾病症状 体征来推求病因 从而提供治疗用药的依据 即辨证求因和审因论治 这种倒果求因的方法是其所特有的 中医学病机研究中特别重视正邪斗争 阴阳失调 脏腑气机升降失常等 认为各种病因所引起的不同疾病其病变机理是复杂多样的 不同的疾病有特殊的病理变化 如不同脏腑的病证 外感与内伤 气病与血病的病理上各有自己的特殊性 但在不同的致病因素引起的表现各异的各种疾病中也存在共同的一般性规律 研究并掌握中医病机的一般规律 可以更深刻了解疾病的本质 指导辨证与治疗 三 根据病因病机理论复制动物模型 1 根据病因造成的病理模型 这种方法的指导思想是 虽然证的现代病理生理变化尚不清楚 但可以假定施以同种病因会引起同样或类似的病理改变 六淫的的动物模型 根据中医 风寒湿三气杂至 合而为痹也 的理论 用人工风寒湿环境可造成风寒湿性家兔痹证模型 又如将大鼠自由饲养于风寒环境中 前期可见动物发热 恶风寒等风寒表证模型 后期出现血液流变异常 微循环障碍 畏寒喜暖 少动 耳廓和唇周暗红等血瘀症状 造成寒凝血瘀证模型 应用疏风活血药治疗后 证候可明显改善 七情的动物模型 根据中医喜伤心 悲伤肺 恐伤肾 怒伤肝 思伤脾的论点 有人用激怒大鼠的方法复制 怒伤肝 大鼠模型 有人用 猫吓鼠 或 人吓猫 或 爆竹吓狗 造成 恐伤肾 模型 上述三种方法造成的恐伤肾 模型动物均出现惊恐不安 摄食减少 体重下降 反应迟钝等表现 形态学观察表明三种实验动物睾丸 垂体均有不同程度的病理改变 2 根据中医病机造成的模型 各种致病因素作用于人体所引起的疾病发生发展与变化的机制称病机 以中医病机为依据可造成气虚 血虚 脾虚 血瘀等动物模型 如 素问 举痛论 曰 劳则气耗 故有人使大鼠过度游泳劳倦 造成游泳劳损大鼠鼠气虚模型 根据 气为血之帅 血为气之母 的论点 用小量多次放血造成 血虚 或 气血两虚 模型 中医认为跌打损伤可导致血瘀 若因伤折内动经络 血行之道不得宣通瘀积不散 为肿为痛 因此 采用外伤法造成 外伤大鼠血瘀模型 可出现血液流变学等的改变 以 饮食劳倦则伤脾 为依据 可采用劳倦与饮食饥饱失常制作大鼠 脾气虚 证模型 该模型可出现体重下降 外观表现拱背 懒动 毛乱无光泽 血清淀粉酶及胰型同工酶 胰脂肪酶活性显著低于对照组 符合 脾气虚 证患者临床表现 中国中医研究院还以马属动物驴为造模对象 以破气苦降的厚朴三物汤加饮食失节法塑造 脾气虚 驴模型 根据大黄 番泻叶等苦寒泄下药 误下 可致脾失健运 应用大黄 番泻叶复制鼠 脾虚 模型 根据寒凉药易伤阳气 可导致阴寒内生而致寒证 温热药易伤阴助火 内热由生而致热证之说 采用长期大量喂寒凉药或温热药 分别复制出呈现寒症和热证某些特征的寒证或热证大鼠模型 四 根据病证结合 选择某些西医病理模型作为中医证的模型如温病卫气营血大多出现于急性传染病 故采用注射大肠杆菌复制家兔卫气营血模型 动物可出现卫分证 气分证 营分证 血分证表现 卫气营血各组间酌病理变化既有连续性 更有不同时相的阶段性 有人还用大肠杆菌内毒素造成家兔温病营分证模型 根据临床甲亢患者多表现为阴虚火旺 甲减患者出现阳虚 故用甲状腺激素复制甲状腺素大鼠 阴虚 模型 用甲巯眯唑 他巴唑 或丙基硫氧嘧啶造成大鼠 阳虚 模型 由于临床贫血患者大多表现为血虚 故用能引起溶血性贫血的乙酰基苯肼 APH 复制大鼠 血虚 模型 五 根据证的现代病理生理机制复制病理模型如微循环障碍是血瘀病理变化的重要标志 故采用高分子右旋糖酐致外周微循环和脑微循环障碍的方法复制高分子右旋糖酐家兔血瘀模型 又如临床肾阳虚患者有尿17 OHCS 17 羟皮质类固醇 排出量降低 下丘脑 垂体 肾上腺皮质轴功能紊乱的现象 用外源性氢化可的松复制 阳虚 大鼠模型 动物后期可出现一系列耗竭现象 外观有类似肾阳虚证候的临床表现和病理改变 用助阳药治疗后明显改善 近年来又用皮质酮造成大鼠 肾阳虚 模型 观察到补肾药右归饮可使下丘脑室旁核肾上腺皮质激素释放激素 CRH 神经元与正中隆起CRH神经纤维明显增加 右归饮主药附子的主要成分乌头碱可使CRHmRNA表达增加 CRH含量明显升高 提示肾阳虚证的主要调节点定位在下丘脑 而补肾药可直接作用于下丘脑 六 根据整体观念复制动物模型中医学显著特点之一是整体观念 认为人体是以脏腑 经络为内在联系的有机整体 而且与自然界间有着密切的联系 这种整体观也体现在对疾病的发生原因 演变过程的认识及临床辨证论治之中 如证的相互转变 脏腑的相互影响 病因病机的多样性等 因此我们在中医药实验研究中应用动物模型时 应该以中医学整体观念为指导 全面地考虑造模因素 观察造模动物的症状与表现 选择适当的现代科学指标 综合判断复制的动物模型 在中医证的临床及实质研究中发现证常是兼见的 各证在一定条件下也可以相互转化 如寒极生热 热极生寒 就说明在疾病演变过程中关系错综复杂 不能静止地 孤立地 片面地研究中医的证 中医的脏腑之间既有联系又相互影响 如心合小肠 主血脉 开窍于舌 肺与大肠相表里 肝开窍于目等观点都说明脏腑之间 脏腑与形体各组织器官之间的生理 病理等方面的联系 再加之中医病因病机的多样性 在中医药研究中 选择观察指标时不能单纯用西医某些生理 生化 病理及免疫学指标作为判断中医药动物模型的客观依据 1 动物模型很难用四诊方法加以判别在临床上由于病人可以主诉症状 可以观形察色 按脉辨舌 可以分析症状出现的先后 程度的轻重 还可以分辨标本主次 寒热虚实的真假 因此在病人身上得到所需完整的四诊资料 作出较为准确的诊断辨证 但是对复制动物模型要想得到详尽的四诊资料困难较大 有些动物模型虽然也能联系人体疾病的某些症状和体征 但特异性较差 例如阳虚 气虚和寒证的造模动物都可出现进食减少 大便溏 耐寒力低等现象 阴虚 血虚和热证的造模动物都可出现喝水较多 心率增快和尿量减少等现象 而各造模动物都可出现体重减轻 毛发竖立和疏松少泽 因此单凭这些症状 体征较难判断此模型属何证 这些外在表现 证与证之间有没有差别 还缺少深入细致研究的报道 这是中医科研工作者要解决的一个重要问题 四 中医动物模型存在的问题 2 造模因素选择缺少标准目前有关造模的因素很多 有的是西药的 有的是中药的 有的是物理因素 有的是化学因素 究竟哪种造模因素比较符合临床实际 能造出较为典型的中医证型 目前争鸣不止 尚无定论 3 病证分离有的造模设计 忽视临床实际 刻意去追求证 脱离病去制造证 而不是在病 尤其是常见病的模型上去区分证 这种倾向应予纠正 4 关于方药的反证问题以方药药性反证动物模型属何证的方法较为方便 实用 但要注意其局限性 一方面 方药的功效可能是比较广泛的 其适应证 并不一定限于某证 所以有时一种动物模型用几种方药都可能有效 此时方药反证就要慎重 注意抓住主要的一类方药 而且最好用经典的方剂 第四节中医动物模型的复制方法 一 阴 阳 寒 热动物模型二 气虚 血虚 血瘀动物模型三 温病动物模型四 七情六淫动物模型五 五脏证候动物模型六 其他动物模型 选择一些造成与临床证型相仿的致病因素 作用于动物机体使其产生类似临床某些证的模型 而致病因素不外乎物理 化学 生物以及某些内脏损伤或切除等 其造型所用动物主要还是小动物 大 小鼠 也有用金黄地鼠 家兔和猫的 给药 或作用 途径除胃饲外 还有肌肉 皮下 腹腔及耳缘静脉注射等 一 阴 阳 寒 热动物模型 1 甲状腺素致阴虚模型L 甲状腺素钠能促进蛋白质 脂肪分解利用 加速糖原的分解 使机体氧化加速 产热量增加 基础代谢率升高 所以大剂量给予实验动物 可以出现类似甲亢阴虚证症状 动物与方法 雄性小鼠 体重25 30g 每日每鼠皮下注射L 甲状腺素钠4mg ml 连续4天可出现甲亢阴虚症状 结果 用药4天后小鼠出现体重下降 体温上升 大便干燥 饮水量和食量增多 活动增加 评价 模型复制周期短 症状明显 常作阴虚火旺模型用 2 氢化可的松致阳虚模型氢化可的松系肾上腺糖皮质激素 较大剂量外源性氢化可的松进人体内可反馈性抑制垂体释放促肾上腺皮质激素 ACTH 的释放 停药后造成暂时性肾上腺皮质功能低下 出现类似阿狄森病症状 动物与方法 小鼠 雄性 体重20 30g 以大剂量氢化可韵松肌肉注射llng 只 每日1次 用药7次后出现暂时性肾上腺皮质功能低下症 结果1体重减轻 拱背少动 反应迟钝 萎靡不振 竖毛 但表现程度轻重不一 评价 本模型对研究中医虚证 实证实质及补肾药作用机制有一定意义 从助阳药对模型的反证作用来看 此模型有 阳虚 证的特点 可作为 阳虚 模型应用 但有个体差异及病变程度轻重不一的不足 3 甲基硫氧嘧啶致阳虚模型甲基硫氧嘧啶能阻止甲状腺内酪氨酸碘化以及碘化酪氨酸的组合 从而抑制甲状腺素的合成 大剂量给予动物可使其甲状腺机能低下 出现一系列拟阳虚症状 动物与方法 小鼠 18 25g 雌雄各半 给普通饲料 饮自来水 每日灌胃甲基硫氧嘧啶7 5mg 只 用药1周即成 结果 动物体重减轻 毛松 神疲乏力 拱背少动 耐寒力下降 游泳时间缩短 评价 成功率较高 95 存活时间较长 1个月以上 4 温热 寒凉中药致 寒证 热证 模型本方法根据温热 寒凉中药药性造模型 动物与方法 大鼠 雌性 体重170 220g 热证型 用温热药 附子 于姜 肉桂 党参 白术制成100 水煎剂 灌胃 每次2ml 每日2次 寒证型 首先腹腔内注射三联疫苗lml 每日1次 共2次 然后予寒凉药 龙胆草 黄连 黄柏 银花 连翘 石膏制成100 的水煎剂 灌胃 每次2ml 每日2次 15天后出现症状 结果 寒证型 心率减慢 外型畏缩 尿内儿茶酚胺及17 羟皮质激素排出减少 热证型 心率加快 饮水量增多 尿内儿茶酚胺及17 羟皮质激素排出量增多 评价 以临床为基础 用寒凉 温热中药造型 形成相似临床寒 热证象模型 存活时间长 缺点为成功阳性率不高 60 70 周期长 个体差异较大 二 气虚 血虚 血瘀动物模型 1 气虚证动物模型 实验材料 125ml广口瓶 125ml广口瓶橡皮塞 纱布 秒表 钠石灰 10只18 20g小鼠 雌雄兼用 实验方法 称钠石灰0 5g 包于纱布内置于广口瓶中 取18 20g小鼠放于广口瓶中 迅速用橡皮塞塞紧瓶 同时按下秒表 约15分钟后 取出小鼠 实验结果 经处理后的小鼠 呼吸急促 行动迟缓 甚至不动 表情呆滞 萎顿 与气虚临床表现相仿 评价 该法制作气虚模型 方法简单 致病因素单一 时限短 无药物影响 适合气虚证的动物模型 2 血虚证动物模型模型A 实验材料 特制玻璃毛细吸管 天平 20 30g小鼠10只 雌雄兼用 实验方法 用特制的毛细吸管从小鼠眶后静脉放血 隔日一次 共10次 放血第1次量为总血量的20 以后各次减为15 并限食 模型B 实验材料 眼科剪刀 天平 10只18 22g雄性小鼠 显微镜 计数器 实验方法 剪去鼠尾尾尖约0 3cm 采血化验 5ml 放血24小时后 再采血化验 可见血虚状态指标 实验结果 经处理的动物表现皮毛疏松 无光泽 萎靡不振 少动 红细胞及血红蛋白计数明显低于正常 与血虚的临床表现相仿 评价 上述两种动物模型共同特点 制作简单易行 时限短 成功率高 宜于急性失血性贫血的研究 模型C 实验材料 5ml注射器 3号注射针头 天平 2 乙酰苯肼 APH 生理盐水 显微镜 计数器 载玻片 染色液 30只180 250g大鼠 雄性 实验方法 对照组不加任何处理 两组均喂以普通饲料 自由饮水 实验组动物分别于实验的1 4 7天皮下注射2 APH生理盐水溶液 第1次剂量为lml 100g体重 第2 3次剂量减少为0 5ml 100g体重 实验中 每日上午尾巴取血以测定血红蛋白和红细胞数 用甲基紫染色显示红细胞的中毒性颗粒 海氏小体 用烟焦油蓝染色显示网织红细胞 实验结果 实验大鼠在注射APH后第3天开始出现神疲乏力 行动迟缓嗜睡 困缩弓腰 喘促心悸 面 眼 耳 尾苍白而凉 毛蓬竖而少光泽 注射APH后 血红蛋白 红细胞总数则显著增多 显示出贫血性血虚状态 评价 该法制作时限较短 方法较先进 既从临床症状又从实验指标上反映血虚证的主要特征 3 血瘀证动物模型模型A 实验材料 小鼠 雄性 18g左右10只 尖头剪一段 橡皮膏 保温瓶 冰块 秒表 生物显微镜1台 实验方法 将小鼠固定于有机玻璃板上 置于显微镜下进行耳廓微循环观察 放于0 冰块中浸冻15分钟 结束浸冻后 将小鼠置于显微镜下进行耳廓微循环观察 实验结果 实验处理后小鼠耳廓微循环明显缓慢 甚至血流呈粒状或停滞 评价 该法制作血瘀模型 方法简单易行 致病因素单一 且无药物影响 适合于寒凝血瘀动物模型制作 模型B 实验材料 家兔20只 体重I 7 2 5kg 雌雄兼用 25 尿醋 微循环镜 内毒素 大肠杆菌 O 101型 实验方法 取家兔以25 尿醋18 ks作静脉麻醉 用微循环镜观察兔眼球结膜微循环 自耳缘静脉注入内毒素 4小时后再观察微循环血流状态 红细胞聚集情况以及微血管渗出情况 实验结果 注入内毒素后微循环改变 血流速度变慢 以线流为主转为以粒流为主 血细胞聚集程度增高 出现微血管周围渗出 前后对比变化均很明显 评价 在家兔动物模型中 血瘀证的基本病理改变均能得以显示 因此 静脉注射内毒素在家兔身上制造急性血瘀证模型是可行的 1 卫 气 营 血证侯动物模型这是目前运用较多的中医动物模型 其造模因素主要是细菌和内毒素 1 造模方法取健康白兔 体重2 0 2 5kg 大肠杆菌用量为20亿个细菌 2 109 kg体重 容量为1ml kg经耳缘静脉缓慢注入 动物从注入大肠杆菌后应连续进行观察 当出现卫 气 营 血证候的典型症状时 迅速取血送检 同时经动脉放血处死动物 立即进行病理解剖 组织学检查 2 结果 卫分证候 注人大肠杆菌后15 25min内兔出现典型的卫分证候 动物表现为蜷缩 耸毛 懒动 喷嚏 不饮 不食 发热或未发热 神清 耳血管收缩 病理检查 双肺轻度充血 有少数出血点 镜下见肺 心 肝 脾 肾等器官组织内轻度充血 肺 脾组织内有少量中性白细胞呈灶性浸润 三 温病动物模型 气分证候 注人大肠杆菌后35 90min 兔出现不同程度的气分证候 气分阶段可持续2 4h 个别在5h后才转入营分 气分证候阶段动物表现体温升高 口渴饮水 吃食 神清 时有烦躁 心率加快 呼吸增粗并加深 耳血管较卫分时舒张 眼球结膜轻度充血 舌质红 苔淡薄 病理检查 肺 肝 肾 脑 胃肠均明显充血 双肺有点 片状出血 镜下可见组织器官内有淤血 水肿 多数病灶内或病灶周围有渗血或出血 营分证候 注入大肠杆菌后4 6h 兔出现典型的营分证候 此阶段可持续24h 营分证可表现为发热不饮 懒动不食 反应迟钝 心率增快 耳血管收缩 全身体表出现斑疹 眼球结模充血明显 或有点状出血 尿少便溏 舌质红绎 苔多淡黄 病理检查 多个器官 皮下 眼结膜等组织重度充血水肿 双肺多处出现点 片状出血 其间有大小不等的脓点 镜下见组织器官瘀血水肿比气分证更严重 肺 脾 淋巴结内急性炎症反应明显 双肺有小脓肿形成 肝细胞出现点状坏死 血分证候 多在注入大肠杆菌后6 20h