枯草芽孢杆菌表达手册 个人翻译中文版.pdf

枯草芽孢杆菌表达载体 产品信息和说明 2005 年 11 月 目录 1 简介 3 2 pHT 载体 3 2 1 pHT01 载体图谱 4 2 2 pHT43 载体图谱 5 2 3 pHT01 衍生物中标签的定位 5 3 实验方案 6 4 参考文献 6 5 订单信息 运输和存储 6 本载体系统由德国拜罗伊特大学遗传研究所的沃尔夫冈 舒曼实验室 开发 仅用于科研 仅用于科研 本手册由本手册由 wy135033405 翻译翻译 百度文库首发百度文库首发 任何意见请任何意见请 PM 枯草芽孢杆菌表达载体 通过质粒在枯草芽孢杆菌中高效表达胞内 胞外重组蛋白 1 简介 革兰氏阳性菌因其在农业 医疗和食品生物技术和重组蛋白生产等方面的贡献而广为人 知 在所有革兰氏阳性菌中 枯草芽孢杆菌载体因下列原因尤为引人瞩目 一 无致病性 且一般认为安全的有机体 二 无明显的密码子偏好性 三 可直接将功能性胞外蛋白分 泌到培养基中 目前 大约 60 的市售酶由芽孢杆菌生产 四 具备包含转录 翻译 蛋白质折叠 分泌机制 遗传操作和大规模发酵的大信息量机体 但是下述两个障碍减少了枯草芽孢杆菌的使用 一 产生一定数目的识别并降解外源 蛋白的胞外蛋白酶 二 载体质粒稳定性 第一个障碍已因蛋白酶缺失株的构建而基本解 决 第二个因引入使用 复制模式质粒被完全克服 如由天然质粒pAM 1 和pBS72 衍生的 一些质粒 Janni re等 1990 Titok等 2003 最近 基于大肠杆菌 枯草杆菌穿梭质粒pMTLBS72 的四种不同表达载体的构建和使用展 示出全面的结构稳定性 业已出版 Nguyen等 2005 两个新的载体pHT01 和pHT43 允许在细胞质中高水平表达重组蛋白 其中pHT43 载体 引导重组蛋白到培养基 这两个载体基于强 A 依赖性启动子的枯草杆菌groE操纵子通过添 加lac操纵子改造成为一种高效可控的 IPTG诱导的 启动子 pHT01 衍生载体可与 8 His 标签 pHT08 链球菌标签 pHT9 或C Myc的标签 pHT10 相结合 2 pHT 载体 所有在枯草芽孢杆菌的groESL操纵子之前使强启动子与lac操纵子融合的载体都可通 过加入IPTG进行诱导 尽管当未添加诱导物时表达组件的背景表达水平很低 还是成功从 约 1300 种诱导因子中筛选出一种来使用bgaB报道基因 Phan等 2005 当分别将htpG 和pbpE基因融合到groE启动子时 加入IPTG后 表达的重组蛋白可能分别占细胞总蛋白的 10 和 13 Phan等 2005 热纤梭菌的amyQ 淀粉酶和纤维素酶A B的高水平表达实 验证实 该载体还插入了一个高效SD序列以及一个多克隆位点 BamH I Xba I Aat II Sma I 编码 淀粉酶的amyQ基因的信号肽编码区域与pHT01 的SD序列融合 构成了pHT43 以此获得分泌的重组蛋白 2 1 pHT01 载体图谱 Pgrac Pgrac 启动子 包含 groE 启动子 lacO 操纵子和 gsiB SD 序列 CoIE1 ori CoIE1 起始子 AmpR 青霉素抗性基因 LacI lacI 基因 lac 抑制子 CmR 氯霉素抗性基因 完整的DNA序列可根据要求提供 2 2 pHT43 载体图谱 Pgrac Pgrac 启动子 包含 groE 启动 子 lacO 操纵子和 gsiB SD 序列 CoIE1 ori CoIE1 起始子 AmpR 青霉素抗性基因 LacI lacI 基因 lac 抑制子 CmR 氯霉素抗性基因 SamyQ amyQ 信号序列 完整的DNA序列可根据要求提供 2 3 pHT01 衍生物中标签的定位 pHT08 中 8 His 标签的定位 pHT09 中 Strep 标签的定位 pHT10 中 c Myc 标签的定位 3 实验方案 对大肠杆菌和枯草芽孢分子遗传操作 生长 转化等 的详细协议可以在有关实验室手册如 Sambrook和Russell 2001 年 中可以找到 对于枯草杆菌改造我们推荐Anagnostopoulos和 Spizizen 1961 的方案 需稍加修改 1 20mL LS 培养基 Spizizen培养基 补充加入 0 5 葡萄糖 5 g mL DL 色氨酸 5 g mL 尿嘧啶 0 01 干酪素水解物 0 1 酵母提取物 Difco公司 1mM MgSO4 2 5mM MgCl 0 5 mM CaCl 中接种在HS培养基 Spizizen培养基 补充加入 0 5 葡萄糖 5 2 2 g mL DL 色氨酸 5 g mL 尿嘧啶 0 01 干酪素水解物 0 1 酵母提取物 Difco公司 8 g mL 精 氨酸 0 4 g mL 组氨酸 1mM MgSO 中 37 C过夜培养的 5mL中的 1mL 30 C缓慢摇 3 到 4 小时 4 oo 2 用 10 L的 0 1M EGTA室温孵育这 1mLHS培养物 5 分钟 对数晚期 稳定早期 OD 而后加入 1 2 578 g质粒DNA 3 37oC摇 2 小时供其发展抗生素抗性后将细胞涂布至选择性平板 Spizizen培养基配方 2g NH4SO4 14g K2HPO4 6g KH2PO4 1g 柠檬酸钠 加 100mL蒸 馏水 高压灭菌 然后再加 0 1mL 1M MgSO4 4 参考文献 Anagnostopoulos C and Spizizen J 1961 Requirements for transformation in Bacillus subtilis J Bacteriol 81 741 746 Janni re L Bruand C and Ehrlich S D 1990 Structurally stable Bacillus subtilis cloning vectors Gene 87 53 61 Nguyen D H Nguyen Q A Ferreira R C Ferreira L C S Tran L T and Schumann W 2005 Construction of plasmid based expression vectors for Bacillus subtilis Plasmid in press Phan T T P Nguyen H D and Schumann W 2005 Novel plasmid based expression vectors for intra and extracellular production of recombinant proteins in Bacillus subtilis Protein Expr Purif in press Sambrook J and Russel D W 2001 Molecular Cloning A laboratory manual Titok M A Chapuis J Selezneva Y V Lagodich A V Prokulevich V A Ehrlich S D and Janni re L 2003 Bacillus subtilis soil isolates plasmid replicon analysis and construction of a new theta replicating vector Plasmid 49 53 62 5 订单信息 运输和存储 订单号 PBS001 PBS002 PBS003 PBS004 PBS005 描