金免疫分析技术.ppt

金免疫分析技术 主要内容 1 胶体金的制备原理 方法 注意事项 质量鉴定 胶体金保存2 免疫金的制备原理 技术要点3 免疫金测定技术 斑点金免疫渗透试验的原理 技术类型 斑点金免疫层析试验的原理 技术要点 临床应用及评价 胶体金 colloidalgold 也称金溶胶 goldsol 是金盐被还原成原子金后形成的金颗粒悬液 什么叫胶体金 zeta电位可以使胶体金颗粒之间相互排斥 以维持胶体金的稳定状态 基础金核双离子内层负离子 AuC12 zeta电位外层离子层H 分散在胶体间的溶液中 胶体金的制备 制备原理 还原法 用一定量的还原剂把一定浓度的金盐溶液还原成金离子 常用的金盐是氯金酸还原剂是枸橼酸钠 鞣酸 维生素C 白磷 硼氢化钠 胶体金的制备 制备方法 氯金酸水溶液加热沸腾 搅拌着加入枸橼酸钠水溶液 金黄色的氯金酸水溶液在2min内变为紫红色 再煮沸15min冷却后以蒸馏水恢复到原体积 胶体金的制备 注意事项 1 玻璃容器的清洁容器使用前必须酸洗和硅化硅化的一般过程用5 的二氯二甲硅烷的氯仿溶液浸泡玻璃容器1min 室温干燥后 用蒸馏水冲洗 在干燥备用 2 试剂 水质和环境 使用氯金酸时不能用金属药匙 避免接错天平秤盘 双蒸馏水 实验室尽量无尘 pH值3 0 5 8的柠檬酸磷酸盐 pH5 8 8 3的Tris HCL和pH值8 5 10 3的硼酸氢氧化钠等缓冲容量大的缓冲系统 但应控制浓度不要太高 胶体金的制备 质量鉴定和胶体金保存 质量鉴定 外观检查清亮透明悬液 颗粒大小与均一性检查肉眼观察或分光光度计扫描或者电镜检查 胶体金保存洁净玻璃器皿 放入少量防腐剂 少量分装备用 免疫金制备 胶体金与抗原抗体等大分子物质结合形成 制备原理 将蛋白质吸附到胶体金颗粒表面而结合的过程环境pH值和离子强度是影响吸附的主要因素 免疫金的制备 技术要点 胶体金溶液pH值的调配0 2mol LK2CO3或者0 1mol LHCl调整到标记蛋白质带等电点货稍偏碱 通常要经多次试验 蛋白质最适用量的确定用标记蛋白质作系列稀释 分别取0 1ml蛋白质稀释液加入1ml胶体金溶液中 并设不加蛋白质的对照管加入10 NaCl溶液0 1ml混匀 静置2小时 选以红色不变管中蛋白质含量最低为稳定1ml胶体金所必需蛋白质的量 胶体金的标记按照最适比 在电磁搅拌下将所需要量的胶体金加入一定量的蛋白质溶液中 加入一定量的稳定剂 调整pH至8 5 离心 轻吸上清液 用缓冲液悬浮 恢复原体积后再离心 重复操作2 3次 胶体金结合物的纯化与鉴定纯化 超速离心法和凝胶过滤法鉴定 电镜测定颗粒的平均直径以及免疫组化滤纸模型测定结合物的特异性 敏感性 保存用稀释液配制成工作浓度保存 金免疫测定技术分类 斑点金免疫渗滤试验DIGFA dotimmuno goldfiltrationassay 斑点金层析试验DICA dotimmunogoldchromatographicassay DIJFA 将抗原抗体点加在固相载体硝酸纤维素薄膜上 制成抗原抗体包被的微孔滤膜并贴置于吸水材料上 标本中的抗原抗体被膜上的抗体抗原捕获 无关蛋白随液体滤出 加入胶体金标记物在渗滤中与相应的抗原抗体结合 阳性反应 膜上呈现红色斑点 斑点金免疫渗滤试验 原理 斑点金免疫渗滤试验 DIGFA 双抗体夹心法测抗原 DIGFA 间接法测抗体 抗体结合在微孔滤膜的中央 加待测标本 加金标抗体 洁洗涤剂后 阳性结果 膜中央呈现红色斑点 斑点金免疫渗滤试验 DIGFA 间接法测抗体 斑点金免疫渗滤试验 DIGFA 双抗体夹心法测抗原 操作 加样A 加金标记物 洗涤B 观察 具体步骤如下 1 将反应板平放于实验台上 于小孔内滴加血清标本A1 2滴 待完全渗入 2 于小孔内滴加金标记物物试剂1 2滴 待完全渗入 3 于小孔内滴加洗涤液B2 3滴 待完全渗入 4 判读结果 在膜中央有清晰的淡红色斑点显示者判为阳性反应 反之 则为阴性反应 斑点呈色的深浅相应地提示阳性强度 斑点金免疫渗滤试验 DICA 原理 斑点金层析试验 斑点金层析试验图示 斑点金层析试验 DIGFA穿流 flowthrough DICA横流 lateralflow 斑点金层析试验 斑点金层析试验 C阴性 B阳性 DICA 双抗体夹心法测抗原 斑点金层析试验 DICA 间接法测抗体 C阴性 B阳性 斑点金层析试验 阴性 弱阳性 阳性 DICA 竞争法测抗原 检测线颜色强度与SD浓度负相关 斑点金层析试验 临床应用及评价 金免疫测定技术 检测HCG AFP 轮状病毒