分子病理检测在神经肿瘤治疗中的应用.ppt

分子病理检测在神经肿瘤治疗中的应用 一 什么是分子病理二 分子病理检测与神经系统肿瘤治疗三 分子病理检测常用技术四 以胶质瘤为例简述分子病理检测在肿瘤治疗中的应用1 O6 甲基鸟嘌呤 DNA甲基转移酶 O6 methylguanine DNAmethyltransferase MGMT 基因启动子甲基化的检测2 染色体1p 19q杂合性缺失 一 什么是分子病理 概念 分子病理是近些年在传统组织病理学的基础上结合了分子生物学及分子遗传学的研究成果 并采用相关的分子生物学技术逐渐发展完善起来的 一 什么是分子病理 研究内容 在基因和蛋白水平上检测肿瘤细胞的受体 生长因子 染色体 抑癌基因及基因等的变化 因此了解肿瘤细胞的分化 生长速度 转移侵袭性及对抗化疗和放疗的可能性等相关信息 可以为临床医生提供有价值的资料 从而做到有针对性的指导神经系统肿瘤的综合治疗 二 分子病理检测与神经系统肿瘤治疗 随着人类基因组计划的完成 基因在肿瘤发生发展中的作用也渐渐被揭示 肿瘤的发生和发展是多因素参与的 多步骤的过程 关键调控基因的突变导致了基因表达的失衡 在致癌基因主导的情况下 细胞恶性增殖 阻止了正常细胞的分化和凋亡 最终导致肿瘤的发生 而抑癌基因编码的蛋白对细胞的负性调控作用则大大降低 最终导致肿瘤的发生 二 分子病理检测与神经系统肿瘤治疗 分子病理学检测抑癌基因 癌基因等变化并通过免疫组化标志物 在基因或蛋白水平上对肿瘤细胞的受体 生长因子进行检测 依据这些指标 精确地判断某一具体肿瘤细胞的生物学行为 有针对性地设计不同的治疗方案 二 分子病理检测与神经系统肿瘤治疗 目前的挑战 找到与神经肿瘤治疗 预后相关的因子 探索致癌基因与抑癌基因在药物作用下的反应 为临床肿瘤药物治疗提供指导 实现个体化治疗 二 分子病理检测与神经系统肿瘤治疗 表皮生长因子受体EGFR是目前研究最多的靶点 在1 3的脑胶质母细胞瘤中表达增加 针对的EGFR的分子靶向治疗的药物可分为两类 一类是酪氨酸激酶抑制剂 tyrosinekinaseinhibitor TKI 与细胞内酪氨酸激酶结合并其功能抑制 TKI已于2003年在美国上市 2005年在我国上市 另一类是人工合成的单克隆抗体 MAb 可与EGFR的细胞外结合区域结合 从而阻断配体与EGFR的结合与活化 MAb已于2004年在美国上市 均可影响癌细胞的信号传递系统 从而抑制癌细胞的增殖 分化 侵袭性生长 以上两种针对EGFR的分子靶向治疗的药物可明显提高患者的生存质量并改善患者的症状 二 分子病理检测与神经系统肿瘤治疗 星形细胞瘤弥漫浸润性生长 手术很难做到全部切除 术后容易复发 肿瘤的恶性程度可能升级 分子病理学的研究结果表明 这类患者的预后并不完全相同 分化较好的星形细胞瘤演变成胶质母细胞瘤 关键基因是位于17染色体短臂p53发生突变 p53是抑瘤基因 是继发胶质母细胞瘤发生的始动基因 年轻的胶质瘤患者 p53发生突变 对放疗与化疗相对敏感 相对存活期长 而EGFR过度表达的胶质母细胞瘤的老年患者 对放疗与化疗反应差存活期短 二 分子病理检测与神经系统肿瘤治疗 ki 67是一种细胞增殖核抗原 目前较为肯定的核增殖标志基因 分子病理检测 ki 67表达阳性 说明胶质瘤处于s期细胞较多 这类患者在治疗上 不宜于手术后放疗 而应在放疗之前选择对s期细胞敏感的化疗药物 先杀灭s期细胞后 再进行放疗 形成一种新的序贯疗法 S期是DNA复制期 在这个时期对肿瘤药物治疗的研究是合理的 因为肿瘤是细胞周期紊乱引起 S期下进行药物治疗研究 可以对细胞分裂关键时期的各种酶 基础物质 DNA复制等关键环节的控制 找到治疗方案 二 分子病理检测与神经系统肿瘤治疗 阻断血管生成是遏止肿瘤生长的有效策略 肿瘤的生长依赖肿瘤血管供应营养随着人们对肿瘤血管形成机制的了解 针对肿瘤血管形成的分子机制所设计的抗血管生成治疗策略 已成为目前肿瘤治疗的热点研究领域 许多抑血管生成剂已进入临床试验 PTK ZK是口服的VEGFR vascularendothelialgrowthfactorreceptor VEGFR 酪氨酸激酶抑制剂 有抗肿瘤活性 整合素 integrins 参与介导细胞与细胞外基质的粘附 细胞迁移 侵袭及新生血管形成 最近发现 侵袭性黑色素瘤细胞能形成无血管内皮细胞被覆的 由细胞外基质界限的管腔 它不同Angiogenesis 所以 将其称为血管生成拟态 vasculogenicmimicry VM 国内外研究表明整合素 3在人脑胶质瘤有明显表达 且随着胶质瘤病理级别升高表达水平随之明显升高 Vander等发现某些血管生成抑制剂对能明显抑制内皮细胞形成管道 而对VM管状结构无影响 提示VM和新生血管生成有不同的机制 VM的肿瘤治疗措施自然也成了人们倍感兴趣的领域 研究发现 VM调节通路 与某些血管生成调节通路有共同的分子参与 对这些分子作用位点的深入研究 将会为研发更加有效的肿瘤治疗手段提供线索 二 分子病理检测与神经系统肿瘤治疗 小结 从以上4个与临床抗神经肿瘤药物疗效相关的基因和分子来看 药物相关基因和分子改变影响肿瘤细胞的增殖 凋亡 血管生成 侵袭和转移等一系列生物学行为 针对肿瘤组织或细胞在上述通路上所具有的特异的基因和分子特点采取个体化治疗治疗有很大优势 三 分子病理检测常用技术 分子杂交检测 包括原位杂交 荧光原位杂交 对比基因组杂交 近年发展较快的荧光原位杂交和对比基因组杂交在肿瘤分子诊断中具有重要的应用价值 原位PCR技术作为一种敏感性高 特异性强 能在组织细胞原位进行低拷贝数基因定位的研究方法 在分子诊断中发挥了重要作用 其灵敏度比原位杂交高出2个数量级 是形态学和分子生物学前沿交叉的产物 对前沿研究和学科发展起着巨大作用 Anderson曾在1994年生动地指出 原位PCR使光学显微镜超过电子显微镜在向生物化学和遗传学领域延伸 三 分子病理检测常用技术 基因突变及其检测方法 研究已成为生命科学研究的热点 1985年以前 主要应用Southern杂交 可筛选出基因的缺失 插入和移码重组等突变形式 对于不能用该法检测的突变 也可用NDA序列测定分析 但复杂费时 促进了基因突变检测技术的发展 目前大部分基因突变检测技术都是以PCR为基础 已达20余种 比较成熟的技术包括PCR SSCP法 杂合双链分析法 突变体富集PCR法 变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳法 化学切割错配法 等位基因特异性寡核苷酸分析法 DNA芯片技术 连接酶反应 等位基因特异性扩增法 RNA酶A切割法 荧光原位杂交 寡核苷酸引物原位DNA合成法 比较基因组杂交法和DNA序列分析等 三 分子病理检测常用技术 基因过表达产物的检测 蛋白质水平基因表达产物的检测最常用的方法为免疫组化技术 也可应用酶联免疫吸附和Western蛋白印渍法 新一代测定方法为流式细胞仪法 flowcytometry 更新的影像细胞测试法 imagecytometry 则可应用特定波长的光密度进行积分 进行特定蛋白质的定量分析 基因扩增的检测 基因扩增主要表现为基因拷贝数的增加和转录产物mRNA的增加 经典方法为DNA和RNA和印渍杂交 但应用更普遍的为组织细胞原位核酸分子杂交 包括原位杂交 荧光原位杂交 对比基因组杂交 近年发展较快的荧光原位杂交和对比基因组杂交在肿瘤分子诊断中具有重要的应用价值 三 分子病理检测常用技术 核酸序列测定DNA的碱基序列决定着基因的特性 DNA序列分析 测序 sequencing 是分子生物学重要的基本技术 无论从基因库中筛选的癌基因或经PCR法扩增的基因 最终均需进行核酸序列分析 可藉以了解基因的精细结构 获得其限制性内切酶图谱 分析基因的突变及对功能的影响 设计引物 以及研究肿瘤的分子发病机制等 测序是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上建立起来的 成人中最常见的脑肿瘤是恶性胶质瘤 确诊后基本死亡率平均一年 即使在积极地外科手术和放射治疗后 这就造成临床上同一种肿瘤有着两种或者多种截然不同的对化疗不同的敏感度和不同的预后的现象 给临床治疗带来了诸多不便 目前 比较明确地和恶性脑胶质瘤临床化疗相关的分子是MGMT启动子甲基化和染色体1p 19q杂合性缺失 下面仪详细介绍这两种协助应用于脑胶质瘤的治疗的分子生物学检测 以PCR技术为基础O6 甲基鸟嘌呤 DNA甲基转移酶 O6 methylguanine DNAmethyltransferase MGMT 基因启动子甲基化的检测 荧光原位杂交技术 fluorescenceinsituhybridization FISH 检测染色体1p 19q杂合性缺失 MGMT启动子甲基化 MGMT是一种从细菌到哺乳类动物机体中都存在的独特的DNA修复蛋白 MGMT能够修复被化疗药物烷基化的鸟嘌呤 增加了肿瘤细胞对这些药物的耐药性 因此如果肿瘤细胞内的MGMT活性升高会减少烷化类化疗药物对肿瘤细胞DNA的损伤 许多研究资料已经证实 MGMT在胶质瘤组织中表达会明显影响亚硝基脲类抗肿瘤药物的治疗效果 MGMT启动子甲基化 Hegi等研究表明 对脑胶质瘤组织中MGMT基因启动子甲基化的患者采用放疗联合替莫唑胺化疗 其生存期要比单纯放疗长 MGMT基因甲基化状态与肿瘤细胞对烷化剂药物敏感性密切相关 普遍认为脑胶质瘤组织中MGMT基因启动子甲基化的患者其临床预后较好 通过检测脑胶质瘤MGMT基因启动子甲基化状况 推测脑胶质瘤对烷化剂类化疗药的敏感性 为在分子水平制定肿瘤化疗的个体方案提供了一定的参考 也成为判断脑胶质瘤患者预后和预测肿瘤对烷化剂化疗耐药性的标志分子 MGMT启动子甲基化 MGMT表达减少 MGMT启动子甲基化 检测基因甲基化的经典方法 甲基化特异性PCR MethylmionSpecificPCR MSP MSP法的原理是首先用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA 所有未发生甲基化的胞嘧啶都被转化为尿嘧啶 而甲基化的胞嘧啶则不变 然后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行聚合酶链反应 PCR 扩增 最后通过琼脂糖凝胶电泳分析 确定与引物互补的DNA序列的甲基化状态 检测MSP扩增产物 如果处理后甲基化DNA链的引物能扩增出片段 则说明该被检测的位点存在甲基化 DNA亚硫酸氢盐转化Me CMe CCU 注意 控制DNA量 DNA量过多假阳性 DNA量过少假阴性 DNA样本提取制备 石蜡切片 组织 外周血 阴性对照正常外周血基因组DNA 阳性对照甲基化基因组DNA 普通PCR仪 MGMT启动子甲基化 问题 这种检测存在问题 只能进行终点检测 扩增产物需要跑胶和手工收集数据和后期处理 实验在一个开放的系统完成 可变因素和人为因素增加 灵敏度也很低 这种方法只能粗略定量甲基化的程度 对于临床诊断的意义比较低 检侧重现性差 只能用作粗略的定性或半定量检测 目前很少用于临床检测 MGMT启动子甲基化 目前推荐的方法是高分辨率熔点曲线分析法 HRM High ResolutionMeltingAnalysis 自WojdaczTK等人2006年多次报道用来诊断MGMT甲基化以来 HRM是公认的快速 准确 相对低成本检测DNA甲基化的方法 已成为目前推荐使用的诊断DNA甲基化的方法 由于它是一种闭管方法 不再需要担心扩增的线性和放射性污染 也不再需要跑胶和手工收集数据 PCR反应产物无需离开反应管即可直接进行检测 减少了外界污染的机会 增加了结果的可靠性 MGMT启动子甲基化 HRM法原理 用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA 所有未发生甲基化的胞嘧啶 C 被转化为尿嘧啶 U 而甲基化的胞嘧啶则不变 在非CpG岛位置设计一对针对经亚硫酸氢钠处理后DNA链的引物 这对引物中间包含有意义的甲基化CpG岛 一旦这些CpG岛发生甲基化 胞嘧啶 C 不发生变化 而未甲基化的胞嘧啶 C 转变成胸腺嘧啶 T 样品中的GC含量发生了变化 最终被转化成了熔解曲线Tm值之间的差异 DNA亚硫酸氢盐转化Me CMe CCU 注意 控制DNA量 DNA量过多假阳性 DNA量过少假阴性 DNA样本提取制备 石蜡切片 组织 外周血 甲基化阳性对照 非甲基化阴性对照 100 50 25 6 2 1 5 0 4 0 对于甲基化较多的PCR产物 GC含量高 Tm值较高 MGMT启动子甲基化 小结 HRM方法除了一台实时荧光PCR仪无需其它仪器1 试剂相对便宜 相比于传统的方法 它的成本低廉 分辨率高 通量灵活 最多一次筛查384个样本 最少几个样本 2 并且准确率大大提升 可以检测出样本DNA中微量甲基化的部分 甲基化DNA仅占0 1 1 3 另外该方法检测所需时间短 现在在2到3小时之内拿到数据已经成为可能 检测染色体1p 19q缺失 少枝胶质细胞瘤 Oligodendroglioma OG 是脑肿瘤中第一个应用分子病理诊断指导治疗的肿瘤 少枝胶质细胞瘤显示特异性的基因改变 借此可以与其他类型胶质瘤区别 同时对于诊断 治疗以及判断预后都有很重要的意义 其中最常见的基因改变是19号染色体长臂 19q 的杂合子缺失 发生率为50 80 其次是1号染色体短臂 1p 的杂合子缺失 发生率为40 92 研究发现 存在lp 19qLOH的少枝胶质细胞瘤对化疗敏感 对复发和首发的少枝胶质细胞患者进行PCV联合化疗 甲基苄肼 环亚硝脲 长春新碱 的疗效是肯定的 1998年 Caimcross等首次报道了1p l9q杂合性缺失具有较长的生存期 44例间变性少枝胶质细胞瘤 存在染色体1p 19q杂合性缺失的皆对PCV方案敏感 50 患者平均生存期为10年 而无1p 19qLOH者平均生存期仅为2年 检测染色体1p 19q缺失 随后许多学者的研究都为利用少枝胶质细胞瘤分子遗传学特征来评价放化疗的疗效提供了有价值的信息 1p单独缺失少见常预示需要放疗与化疗相结合 认为19q缺失可以认为预示肿瘤向好的方向发展 运用荧光原位杂交 FISH 检测技术检测肿瘤1p和 或19q等位基因的单独或联合缺失对少枝胶质细胞瘤的诊断 治疗和预后的判断有积极意义 检测染色体1p 19q缺失 FISH 荧光原位杂交 FlorescenceIn situHybridizationFISH 是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术 FISH技术是用荧光素标记而进行检测的特异性原位杂交 在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计算 最终通过荧光信号的颜色和数目的异常与否 达到疾病诊断的目的 荧光原位杂交可以在石蜡白片上进行而且分辨率较高 检测染色体1p 19q缺失 检测染色体1p 19q缺失 组织病理学检查少突胶质瘤经典组织像表现为中等细胞密度 核均匀 圆形 大小一致 胞浆肿胀 透明 WHO2000年分类将少突胶质瘤分为低级别 级 和间变型 级 两者的差别在于后者常见核分裂 血管增生或者坏死 在常规甲醛固定 石蜡包埋的标本切片上 典型的少突胶质瘤组织像呈剪蛋状 friedeggappearance 肿瘤细胞和蜂巢状 honeycombappearance 组织结构 尽管这种结构是人为的 但对少突胶质瘤却很特异 检测染色体1p 19q缺失 检测染色体1p 19q缺失 检测染色体1p 19q缺失 检测染色体1p 19q缺失 荧光原位杂交的特点 1 快速 2 信号强 3 特异性高 4 多色 FISH有上述优点的原因 使用了荧光标记与检测系统取代放射性标记与检测系统标记探针的物质 1 生物素 biotin 地高辛 digoxigenin 半抗原报告分子 间接标记 2 荧光物质 直接标记 检测染色体1p 19q缺失 染色体复染的物质 PropidiumIodide PI 红色 DAPI 兰色 quinacrine 绿色 检测染色体1p 19q缺失 1p36MicrodeletionProbehybridizedtoametaphasecell AbsenceoftheSpectrumOrangeandSpectrumGreensignalsondistal1p36 arrow indicatesadeletionofbothTelVysion1pandLSIp58 Vysis 荧光原位杂交 人体的细胞一条染色体有两条染色单体的时候只会出现在有丝分裂和减数分裂的时候 因为要进行染色体的复制 荧光原位杂交 FISH 荧光原位杂交实验 原位杂交 2008 03 14内容快照 FISH 荧光原位杂交实验 原位杂交 1 实验目的通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和在生物学 医学领域的应用 掌握原位杂交技术的操作方法 熟练掌握荧光显微镜的使用方法 2 实验原理荧光原位杂交 FluorescenceinsituhybridizationFISH 是一门新兴的分子细胞遗传学技术 是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术 目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究 染色体精细结构变异分析 病毒感染分析 人类产前诊断 肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域 FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针 按照碱基互补的原则 与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合 形成可被检测的杂交双链核酸 由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列 因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位 与传统的放射性标记原位杂交相比 荧光原位杂交具有快速 检测信号强 杂交特性高和可以多重染色等特点 因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注 杂交所用的探针大致可以分为三类 1 染色体特异重复序列探针 例如a卫星 卫星III类的探针 其杂交靶位常大于1Mb 不含散在重复序列 与靶位结合紧密 杂交信号强 易于检测 2 全染色体或染色体区域特异性探针 其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成 可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得 3 特异性位置探针 由一个或几个克隆序列组成 探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法 间接标记是采用生物系标记的dUTP biotin dUTP 经过缺口平移法进行标记 杂交之后用藕联的荧光素的抗生物系的抗体进行检测 同时还可以利用几轮抗生物素蛋白 荧光素 生物素化的抗 抗生物素蛋白 抗生物素蛋白 荧光素的处理 将荧光信号进行放大 从而可以检测500bp的片段 而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸蔌磷酸戊糖骨架共价结合 或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入 直接标记法在检测时步骤简单 但由于不能进行信号放大 因此灵敏度不如间接标记的方法 3 实验用具及材料Y染色体探针 人外周血中期染色体细胞标本 恒温水浴锅 培养箱 染色缸 载玻片 NikonE 400 荧光显微镜 盖玻片 封口膜 200mL移液器 20mL移液器 暗盒 指甲油 甲酰胺 氯化钠 柠檬酸钠 氢氧化钠 吐温20 荧光原位杂交 4 实验方法及步骤1 探针及标本的变性 1 探针变性将探针在75 怛温水浴中温育5min 立即置0 5 10min 使双链DNA探针变性 2 标本变性 将制备好的染色体玻片标本于50 培养箱中烤片2 3h 经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片 取出玻片标本 将其浸在70 75 的体积分数70 甲酰胺 2 SSC的变性液中变性2 3min 立即按顺序将标本经体积分数70 体积分数90 和体积分数100 冰乙醇系列脱水 每次5min 然后空气干燥 2 杂交将已变性或预退火的DNA探针10mL滴于已变性并脱水的玻片标本上 盖上18 18盖玻片 用Parafilm封片 置于源潮湿暗盒中37 要交过夜 约15 17h 由于杂交液较少 而且杂交温度较高 持续时间又长 因此为了保持标本的湿润状态 此过程在湿盒中进行 3 洗脱此步骤有助于除去非特异性结合的探针 从而降低本底 1 杂交次日 将标本从37 温箱中取出 用刀片轻轻将盖玻片揭掉 2 将已杂交的玻片标本放置于已预热42 50 的体积分数50 甲酰胺 2 SSC中洗涤3次 每次5min 3 在已预热42 50 的1 SSC中洗涤3次 每次5min 4 在室温下 将玻片标本2 SSC中轻洗一下 荧光原位杂交 4 杂交信号的放大 1 在玻片的杂交部位加150mL封闭液I 用保鲜膜覆盖 37 温育20min 2 去掉保鲜膜 再加150mLavidin FITC于标本上 用保鲜膜覆盖 37 继续温育40min 3 取出标本 将其放入已预热42 50 的洗脱液中洗涤3次 每次5min 4 在玻片标本的杂交部位加150mL封闭液II 覆盖保鲜膜 37 温育20min 5 去掉保鲜膜 加150mLantiavidin于标本上 覆盖新的保鲜膜 37 温育40min 6 取出标本 将其放入已预热42 50 的新洗脱液中 洗涤3次 每次5min 7 重复步骤 1 2 3 再于2 SSC中室温清洗一下 8 取出玻片 自然干燥 9 取200mLPI antifade染液滴加在玻片标本上 盖上盖玻片 5 封片可采用不同类型的封片液 如果封片中不含有Mowiol 可使封片液产生自封闭作用 为防止盖片与载片之间的溶液挥发 可使用指甲油将盖片周围封闭 封好的玻片标本可以在 20 70 的冰箱中的暗盒中保持数月之久 6 荧光显微镜观察FISH结果先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野 然后打开荧光激发光源 FITC的激发波长为490nm 细胞被PI染成红色 而经FITC标记的探针的探针所在位置发出绿色荧光 由于本实验使用的是Y染色体上的特异序列 因此在男性外周血染色体标本的杂交中呈阳性 即使在末分裂的细胞中 也可以观察到明显的杂交信号 照相记录实验结果 图16 1 附录IFISH相关溶液的配制1 20 SSC 175 3gNaCl 882 g柠檬酸钠 加水至1000mL 用10mol LNaOH调pH至7 0 2 去离子甲酰胺 DF 将10g混合床离子交换树脂加入100mL甲酰胺中 电磁搅拌30min 用Whatmanl号滤纸过滤 3 体积分数70 甲酰胺 2 SSC 35mL甲酰胺 5mL20 SSC 10mL水 4 体积分数50 甲酰胺 2 SSC 100mL甲酰胺 20mL20 SSC 80mL水 5 体积分数50 硫酸葡聚糖 DS 65 水浴中融化 4 或 20 保存 6 杂交液 8mL体积分数25 DS 20mL20 SSC混合 或40mL体积分数50 DS 20mL20 SSC 40mLddH2O混合 取上述混合液50mL 与5mLDF混合即成 其终浓度为体积分数10 DS2 SSC 体积分数50 DF 荧光原位杂交 7 PI antifade溶液PI原液 先以双蒸水配置溶液 浓度为100mg mL 取出1mL 加39mL双蒸水 使终浓度为2 5mg mL Antifade原液 以PBS缓冲液配制该溶液 使其浓度为10mg mL 用0 5mmol L的NaHCO3调pH值为8 0 取上述溶液1mL 加9mL甘油 混匀 PI antifade溶液 PI与antifade原液按体积比1 9比例充分混匀 20 保存备用 8 DAPI antifade溶液 用去离子水配制1mL mgDAPI储存液 按体积比1 300 以antifade溶液稀释成工作液 9 封闭液I 体积分数5 BSA3mL 20 SSC1mL ddH2O1mL Tween205mL混合 10 封闭液II 体积分数5 BSA3mL 20 SSC1mL goatserum250mL ddH2O750mL Tween205mL混合 11 荧光检测试剂稀释液 体积分数5 BSA1mL 20 SSC1mL ddH2O3mL Tween205mL混合 12 洗脱液 100mL20 SSC 加水于500mL 加Tween20500mL 13 TE缓冲液 pH8 0 10mmol LTris HCl 1mmol LEDTA pH7 6 10mmol LTris HCl 1mmol LEDTA pH7 4 10mmol LTris HCl 1mmol LEDTA 14 溶液I 25mmol LTrisHCl pH7 4 10mmol LEDTA 15 溶液II 10 SDS 0 2MNaOH 16 溶液III Kac14 7g HAc5 8mL 加水至50mL 荧光原位杂交 17 LB培养基 胰化蛋白胨10g 酵母提取物5g NaCl10g 加水至1000mL 用5mmol LNaOH调pH值至7 0 附录IIDNA探针的制备质粒DNA克隆的提取 纯化和鉴定 1 用接种环挑取一小块 70 冻存的转化菌 接种于5mLLB培养基中 37 剧烈震荡过夜 2 将收集到的菌液3000r min离心10min 弃掉上清液 3 向菌体沉淀中加入溶液I300mL 溶液II350mL 混匀后将其置于冰浴中片刻 再加溶液III350mL混匀 加酚和氯仿混合液 体积比为1 1 500mL后充分混匀 4 12000r min离心10min 5 取上清液 向其加入600mL异丙醇 充分混匀后以12000r min离心15 30min 弃掉上清液 6 用1500mL体积分数70 乙醇洗涤沉淀2 3次 晾干 7 用TE缓冲液溶解DNA沉淀 8 加水至200mL 以RnaseA 终浓度200mg mL 在50 水浴中消化30min 9 加入酚 氯仿和异丙醇 三者体积比25 24 1 溶液200mL混匀 12000r min离心2min 10 取上清液 再加入氯仿和异戊醇溶液 体积比为24 1 200mL混匀 12000r min离心2min 11 取上清液 以20mL3MNaAc及500mL体积分数100 乙醇沉淀DNA 12 可将上述溶液在 70 放置30min至1h以充分沉淀DNA 然后用12000r min离心15min 13 将沉淀用1 5mL体积分数70 乙醇轻洗 自然晾干 14 用TE缓冲液溶解DNA 15 取1 2mL上述纯化的DNA溶液 于8 0g L琼脂糖 TBE缓冲液凝胶电泳鉴定DNA并检测浓度 16 取1mgDNA 用相应限制性内切酶4 5单位 BSA100 200mg mL 于37 水浴中酶解2 4h 17 电泳观察 根据酶切片段数量及大小 估计DNA克隆插入片段大小 附录III探针的生物素标记探针的标记可采用PCR或缺口平移法来制备 但多数情况下采用缺口平移法来制备 该过程包括以DNaseI在DNA双链上作用产生缺口并以此作为第二反应步骤的作用赳噗 即大肠杆菌聚合酶I自缺口处进行修补合成 在修补合成互补链时将生物素标记的d NTP掺入 从而复制出带有生物素标记的探针 本实验采用缺口平移法 按GIBCO公司提供的方法以biotin 14 dATP标记探针 标记好的探针可以在 20 下长期保存 总反映体积50mL DNA1mg 10 dNTP5mL 10 EnzymeMix5mL 其中10 dNTP为 500mmol LTris HCl pH7 8 50mmol LMgCl2100mmol L 硫基乙醇100mg ml去除核酸酶的牛血清白蛋白0 2mmol LdCTP 0 2mmol LdGTP 0 2mmol LdTTP0 1mmol LdATP 0 1mmol Lbiotin 14 dATP10 酶混合为 0 5units mLDNA聚合酶I0 075untis mLDnaseI50mmol LTris HCl pH7 5 5mmo