2 硝酸纤维素膜上蛋白质固定的问题解决0.doc

NC膜上蛋白质固定的问题解决 市面上的基于膜快速免疫层析装置的数量以非常快的速度增长。主要原因包括偶联技术的提高和产品开发者之间对于设计原理的交流的增多。Figure 1. Achieving a crisp, clear test result, such as in the samples shown here, depends on correct binding of the capture reagent to the membrane. 虽然今天的免疫层析装置的外部结构种类设计品种越来越多，商业化最常见的产品主要有两种简单结构。最普通的形式是侧向流动式或浸入式设计，这些结构在医生诊所检测使用和直接销售给用户，非此常见。另一种较少见的形式是流透设计，需要较强的操作技巧，因此只限于专业使用。 不管用到哪种结构形式，要达到灵敏的和可重复的检测，需要生产者有一个有效的程序来使用捕获线试剂。快速诊断行业中的企业经常活跃在出版关于怎样优化捕获线的方法的资料上。这些文章主要讨论蛋白捕获线试剂固定到硝酸纤维素膜上的基本原理，突出免疫层析试剂开发遇到的共同问题，为开发商提供了深层的指导。因为在侧向流动试剂中，关于蛋白固定的问题很普遍，所以这篇文章主要集中这些系统相关的问题。一、 The Importance of Protein Binding 在免疫层析分析中，固定在膜上的蛋白的主要作用就是作为样品中目标分析物的捕获试剂。由于检测结果完全地依靠捕获试剂在膜上达到良好的固定效果，所以获得高且一致水平的固定蛋白的重要性不言而喻。 尽管自从NC膜首次被用于蛋白固定以来，进行了大量的以NC膜为基础的研究，但是结合的确切机理仍然不明。比较为人所知的作用力有疏水相互作用力、H键、静电相互作用力等，但是对确定作用力的理解和各作用力的贡献还不是很清楚。目前主要有两种假说：第一种认为蛋白质与膜的开始结合由静电相互作用产生，然后依靠他们之间的H键和疏水相互作用来维持它们间长时间的结合。虽然很难证明这种假说，但是这个模型拟合发表的试验数据，通常被模型所接受。 以上两种假说尽管都有实验数据支持，但是实验也表明，任何能够影响疏水相互作用、H键、静电相互作用的因素，都将影响到蛋白质与膜的结合。Figure 2. Problems with protein binding are typically visible in the capture line of an assays test result, as in these examples. 第二种认为蛋白质与膜的开始结合由疏水相互作用产生，而它们间长时间的结合由静电相互作用来完成。这种模型也能和很多发表的数据一致。然而静电机制对用干燥或乙醇固定步骤来固定蛋白的现象不能给出很好的解释。不管蛋白固定的结合力是如何平衡的，产品开发者在优化蛋白固定到特定膜上时的条件时，应该要考虑所有这些作用力。这些考虑应该包括使用材料的选择和材料的处理方法。例如，产品开发者选择了一种明显降低疏水作用和静电作用的缓冲液，蛋白固定的水平可能会急剧下降。同样，普遍认为确保蛋白膜之间长期稳定性，对蛋白固定后的膜的足够的干燥是重要的步骤。生产者选择的材料，会对蛋白结合到NC膜上有影响。干扰蛋白固定的材料可以分为三个大类：非特异性蛋白；干扰静电相互作用的物质；干扰疏水相互作用的物质。通常用的降低蛋白吸附的材料包括能竞争结合位点的物质，如标准增量蛋白（BSA，动物血清等），以及干扰氢键作用的物质（甲酰胺，尿素等）和干扰疏水键的物质（Tween，Triton,或Briji）。人造聚合物如PVA，PEG和PVP也能干扰蛋白固定。它们的作用机理可能是抑制对蛋白-膜结合有重要作用的一个或两个力的复合作用。如果膜上蛋白质的量不足或者膜与蛋白质结合的不牢固，将会出现一些重要的问题。从捕获线的试验结果上我们可以清楚地看到这些现象（如图2）。如果膜上的蛋白质量偏低，捕获线将偏弱并且灵敏度也会降低（如图3）。如果蛋白质失效，蛋白质在膜上固定以前将会发生扩散，捕获线将变得宽而弱，这会结果变得难以说明问题。举一个极端的例子，如果说膜上蛋白质的物理吸附能力足够弱，那么分析蛋白质和表面活性溶液通过膜时将会冲走其上面的反应物，实验结果将产生一条很弱的线或者说根本就是一条模糊的线，这样的试验结果很难说明问题（见图4）这些问题在IVD产业中的产品开发中经常见到，而且很显著的影响了成功的免疫色谱分析的发展。为了弄清楚如何解决这些问题，开发者应该对各种影响蛋白-膜结合的各种因素，包括这些内在的材料和测试所进行的对材料的处理过程，有一个非常熟悉的认识。这些因素将在本文中的第一部分进行讨论。解决这些问题的有代表性的技术方法将在第二部分进行说明。二、 Factors That Influence Protein Binding 在研究蛋白检测试剂固定在NC膜上时，产品开发者应当考虑以下可能会影响蛋白结合机制的五个关键的方面，： 溶解捕获试剂时使用的buffer。 用于固定捕获试剂的膜membrane。 捕获试剂capture reagent本身。 用于蛋白质与膜结合的系统system。 蛋白使用时的环境湿度ambient humidity。 虽然很多开发实验室在研究和描述他们检测过程中使用的缓冲液和膜方面做了很好的工作，但是他们还是不大可能全部研究或优化他们用到的检测试剂和应用系统。这些忽略通常是因为后者在开发之前就经常被考虑到，在开发中很少有机会被改变。由于那些忽略的因素，产品开发者往往没有选择只有集中优化在他们考虑范围内的其他重要因素。1. Capture Reagents.捕获试剂是用来作为捕获试剂并随测试不同而改变的蛋白。无论他们之间差异如何微妙，没有一种蛋白质会与另一种蛋白质完全一样的。更重要的是，不同的蛋白质在不同的膜上的结合水平有很大的差异。因此，在优化过程中，最好是直接用单克隆抗体（如果测抗原），这里蛋白是均一性物质。而用多克隆抗体主要问题是它们有不同的抗原决定基，各种抗原决定基的抗体与膜的最佳结合条件都有细微的差别，这样就增加了优化的难度。IgA、IgM这些分子的存在，由于结构或位阻问题，优化的过程会面临更大的挑战。而象BSA、Protein A、Protein G等大分子蛋白质由于它们的化学性质及分子量的缘故，调节它们与膜的结合特性就更加困难（分子量越大，蛋白质越易吸附到固相材料上）。2. Application Equipment. 应用的设备虽然过去应用捕获试剂的系统也存在这些问题，大多数商业上应用的设备既有优点也有缺点。变量包括能或不能调节检测体的积；处理试片和卡片或膜的能力；使用的速度；后反应速度。最好的解决办法是生产商发现能解决大多数显著实际的问题应用系统，如如原材料限制和系统能力。其他因素可以在特别的应用系统中优化。Figure 5. Comparative binding of IgG and albumin to a range of nitrocellulose membranes from different manufacturers. 未来复制实际的检测条件，用流透系统（检体用在膜表面，通过真空系统透过膜）产生数据。虽然最常用的检测方法是用蛋白溶液处理膜，这种方法允许蛋白分子粘附在膜空隙内，产生多层蛋白代替单层蛋白的结果。这些传统的检测方法产生人工高水平的蛋白结合，不能代表免疫层析分析中真实的结果。3. Ambient Humidity. 环境湿度 环境湿度条件对点膜过程非常重要，它会严重影响C、T线的质量，特别在喷膜系统在使用过程中。如果空气湿度太低，静电荷容易聚集在膜上，这时点膜就容易产生斑点；低湿度也容易在膜表面产生疏水斑。相反，过高的湿度，膜上的毛细作用加强，会引起点上的蛋白快速的扩散，这时点膜就容易引起C、T线变宽或发散。一般来说，最佳的环境湿度应保持在4565%RH。而且，为了保证所有要用的膜材料有均一的特性，点膜前应把膜放到工作环境平衡一段时间。最佳的平衡时间应由实验来确定。4. Optimizing the Application Buffer 使用的缓冲液的优化 因为作为捕获线的检测试剂都不一样，对给定蛋白的固定条件的优化需要考虑缓冲液条件，该缓冲条件不同于其他蛋白。在优化所用的缓冲液时，需要优化的两个重要因素是： 蛋白质的溶解性（蛋白在膜上的最大物理吸附量） 蛋白质分子的稳定性（无论是聚集在膜上还是在溶液中） 确保足够的蛋白被用到检测线上，首先检测蛋白要溶于应用缓冲液中。因为要保证有效的蛋白质溶解度，溶液里就要有一定的离子强度。虽然离子强度能有助于控制试剂的pH，但是离子强度高了，正负离子又会干扰蛋白质与膜的静电相互作用，影响固定。因此，最重要的一点是如何决定一个尽可能低的离子强度溶液而又能保证足够有效的蛋白质溶解在缓冲液里。 如果蛋白质在给定的浓度下在溶液中的物理特性稳定，则它将趋向于溶解在溶液里。但是若它的能量状态有利于形成固相，那么吸附到膜上的蛋白比稳定溶解在溶液里的多。这种能量状态可以通过加入去稳定剂和沉淀剂来形成，然而，如果这类试剂的作用过量了，也会产生一些其它的问题。例如，若蛋白在结合到膜上之前就发生沉淀，那么整个试剂系统就高度不稳定且几乎完全不可再生；可用来吸附到膜上的溶解状态的蛋白量就因此急剧下降；且溶液中的沉淀也可引起如堵塞使用中的设备及闭塞膜上的微孔等现象。有些情况下为了获合适吸附量的蛋白，在生产中或许有必要使蛋白质沉淀。这些对一般规律来说是例外的。 从以上的分析表明，蛋白质与膜的结合能力可以通过调整它所处的缓冲系统的特性来改变，关键的是缓冲液的离子强度、pH值及所用沉淀剂的水平。4.1 . Ionic Strength. 离子强度 在一定范围内的离子强度，一般蛋白质的溶解性将随着溶液离子强度升高而增大，为了使溶液中的蛋白质分子的稳定性降至最低，因此，溶液中应保持尽可能低的离子强度。这样的话使蛋白质与膜的吸附固定的速度上升。开发者也应注意到高盐浓度也会引起蛋白质的沉淀，而且在点样后膜在干燥时，大量盐的存在将干扰测试的灵敏度和稳定性。4.2 . Acidity.酸度 缓冲液的pH 值对蛋白质的特性有极大的影响。一般来说，蛋白质的溶解性在它等电点时是最低的。因此开发者为了尽可能的降低溶液中的蛋白质分子的稳定性，缓冲液中最理想的PH 值应控制在所用的蛋白质的等电点附近。4.3 . Coprecipitating Agents. 共沉淀因素 在调整缓冲液时，为降低溶液中蛋白质分子的稳定性，开发者可以选择加入去稳定试剂沉淀剂。加入沉淀剂的作用是依赖于IgG分子的Fc与Fab片段对加入的试剂有不同的稳定性。这就是在沉淀剂的作用下，Fc片段的稳定性下降远远快于Fab片段，Fc片段的部分去稳定作用导致了更多的疏水基因的暴露，在正常情况下这些疏水基是隐藏在蛋白质分子内部的。因此，不管哪种蛋白质与NC膜结合的机制起作用，因为使用沉淀剂引起的疏水性增加将提高蛋白质的固定到膜上的能力。Figure 6. Varied results from capture lines of 1mg/ml mouse IgG applied using different buffers: (a) 10 mmol phosphate, pH 7.2; (b) 10 mmol phosphate + 3% methanol, pH 7.2; (c) 10 mmol phosphate + 150 mmol NaCl + 3% methanol, pH 7.2; (d) 50 mmol phosphate + 150 mmol NaCl + 1% BSA, pH 7.2; (e) 50 mmol phosphate + 150 mmol NaCl, pH 7.2; (f) 50 mmol phosphate + 150 mmol NaCl, pH 6.0. All samples were detected by a 40 nmol gold-conjugated goat antimouse IgG antibody. 过去最常用的沉淀剂是有机醇，因为有许多理由值得推荐。有机醇的存在能帮助湿润NC膜，减少膜可能带有的静电，并且对溶液中的蛋白质有去稳定作用。在用膜作为免疫分析中，加入3-5%的甲醇能极大地提高它的性能。 几年前就已经知道，在ELISA实验中，使用乙醇来提高蛋白质一固相的结合性能，而现在这已经成为标准方法了。脂肪醇对NC膜结合蛋白的影响首先是在1980年知道的，当时，在蛋白 blotting 实验中加1% 异丙醇作为固定剂被广泛的使用。尽管一些物质如溴化甲基乙胺，硫酸铵等有时作为沉淀剂也有很好的效果。但是它们通常不如有机醇，这些类型的试剂中，甚至是微小浓度的变化都会严惩影响蛋白质的沉淀程度。正因如此，一般情况下，多用有机醇而不用其它物质作为沉淀剂。 综合考虑以上各主要因素，一般情况下，新产品的开发都是以下组合的缓冲液开始的：10mmol 磷酸缓冲液+3%甲醇+PH7 尽管这种缓冲液并不是对所有的蛋白质都是最佳，但是它提供了一个开发过程极好的起始点5. Membrane Effects 膜的影响膜对蛋白质的结合有显著的影响，影响膜的特性的关键因素有以下三个关键因素： 膜的类型 孔径大小 膜的后处理 因为用于T/C线的蛋白种类范围较广，没有任何一个膜可以和所有蛋白都能是最优搭配。不同膜之间的蛋白固定的水平会有显著的差异（Fig.5）。不幸的是，这意味着产品开发者必须再对他们开发的每种产品使用的膜进行研究和优化。然而，在检测能力和测试重复性方面的可能的改进将会是额外工作的充分补偿。 不同类型的膜对同一种蛋白质的结合水平存在着很大的差异，这就意味着任何一个新产品的开发都必须重新筛选膜。5.1 . Membrane Type. 膜的类型 膜的孔径和膜的后处理均相同时，膜的种类也对蛋白质的固定能力产生显著的影响。图5显示了免疫球蛋白和白蛋白对于相同孔径规格但不同厂家的一系列膜对蛋白固定能力的比较。两系列的数据都显示蛋白质结合水平的变化受膜的标准孔径大小的影响不大。从图中比较也可显示对于免疫球蛋白有最佳结合能力的膜不一定对白蛋白也有最佳的结合能力。因此，相关蛋白的结合水平既受膜的种类的影响，也受膜的来源的影响。 对于有固定表面积的一系列膜来说，对蛋白质的结合水平受到组成膜的聚合物的类型及影响膜表面活性的处理试剂的共同影响。膜产品是由各种商业来源的基本聚合物组成的，但每种来源的材料在特性上都有轻微的区别，而且，不同的膜生产厂家生产膜时都有不同的生产工艺。对产品开发来说，总是需要通过实验来比较相关蛋白与他们考虑使用的膜的结合特性。5.2 Pore Size. 孔径大小膜实际的孔径大小由测试它的方法决定，不同厂家用不同的方法检测膜的孔径，因此任何两个相同正常大小孔径的膜如果用相同的方法测量的话其结果会不同(see Figure 7).。Figure 7. Pore size data for nitrocellulose membranes based on data from a Coulter porometer. 孔径大小一般通过直接滤过通过膜检测。但是在滤过（膜的厚度）中的孔径的大小和形状和测流（膜的长度）中的孔径的大小和形状没有任何关系。对测流检测检测来说，常规方法的检测孔径大小并非真的与孔径大小相关。而且，如果测量有塑料背垫的膜，那么由于塑料背垫的阻力影响，在膜的滤过方向检测膜的孔径是不可能的。这样，供应商给出的孔径大小常常没有用测流法检测得到的数据可靠。产品开发者可用厂家标示的孔径来区分不同的膜，但应注意仅限对同一个生产厂家的产品而言。因而不推荐用标示的孔径来区别不同的厂家生产的膜材料。一般来说，标示的孔径没有一套标准方法来确定蛋白质的结合量，特别是在lateral-flow分析中，因此，开发者在开发一个新产品时，建议最好筛选一下膜的孔径范围。虽然正常孔径没有任何重要性，膜的测流孔径和结构对于测流分析检测具有重要作用。对于任何范围内的NC膜，膜结合蛋白质的量都将随着孔径的减小而上升，这是因为膜上实际可用的表面积相对增大的缘故。 对于每一种不同孔径的膜，它大约的表面积可通过看比表面积来估算出来（SAR代表该孔径的膜实际可用的表面积与所用膜平面积的比率 ）。还有一主要的现象是，随膜孔径的减小，膜测流速率也将变小，层析速度减小将提高检测的灵敏度，因为被测试剂将在捕获线停留更长的时间。Figure 8. Water present during the application of posttreatments can make sections of the membrane hydrophobic, resulting in striations or intensity variations in the capture line. Nominal Pore Size (m)Surface Area Ratio (SAR)31105988661263Table I. Surface area ratio data for Whatman nitrocellulose membranes.14 Data produced by BET surface area measurements using nitrogen.综合以上两种现象可以看出，使用膜的孔径越小，可得到的相对灵敏度就越高因此，作为总的指导方针，若开发者最关心的是分析的最终灵敏度，那么就应选择尽可能小孔径的膜；若开发者道德考虑的是分析的速度，那么就应该选择较大孔径的膜。总之，无论需要的是什么，对开发者来说，在产品开发的早期，通一等系列的实验评价，他们总能找到一种最佳孔径的膜5.3 . Posttreatments. 后处理NC膜的生产的一个例行过程是膜的后处理，目的是去掉膜表面的没有聚合的小分子前体或者修饰膜的重湿润性能。在另外的方面考虑，通过这样一些的后处理过程，也可引入一些膜本身没有的痕量物质或者别的一些物质，最终影响膜的性能。在一般情况下，生产者应该知道在膜上需加附加一些什么物质，它们的浓度是多少以及怎样来测量它们的浓度水平。通过这些附加上的物质的作用，可以看到它们对蛋白质与膜结合的水平的影响，膜的层析速率以及对膜的寿命的影响。在大规模的工业生产中，为保持NC膜的显润特性，膜的后处理通常来用一些实践的经验，但是，对于膜在到达客户手里之前及在试剂盒生产中点样T线后，是否进行后处理，仍然存在争论。从商家买来已经处理过的膜可能是一种很好的选择，因为这样的话就可减少试剂盒生产者额外的后处理工作量。这些经处理过膜可以直接拿来到生产中使用，因此，这样就节约了生产设备和生产成本以及生产过程所用的时间。当然，产品开发者在决定是否接受这种已处理过的膜之前，应该考虑到以下一些能引起某些应用中不合适的问题。NC膜在点样捕获线之前进行后处理的一个主要缺点是湿润剂在膜上会移动可漏去，若膜被长期贮存后这种现象将更为明显。膜上湿润剂浓度的改变会影响蛋白质与膜的结合特性，当然也会影响湿润特性及层析速率。这样，在产品使用中的货架寿命将取决于用于膜的湿润剂的浓度、产品生产之前膜放置的时间及某些可能的未知因素。另一方面，若生产者在购买后在内部做膜的后处理工作，那么，应记录好膜上湿润的试剂浓度及做好它们在膜上老化的研究工作。这样开发者就能够创建一个适当的后处理程序来确保膜的使用和长时间保存。未处理过的NC膜，其亲水性是与它的孔径结构直接相关。但是经过亲水性试剂处理过的膜，其亲水特性就由其后处理试剂来决定了。如果膜在贮存过程中发