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WesternBlot 免疫印迹技术 一 原理二 步骤1 蛋白质的分离2 转移3 免疫学检测 一 原理 蛋白质样品经过SDS PAGE分离后 通过转移电泳或直接印迹方式原位转移至固相介质上 并保持原有的物质类型和生物学活性不变 然后应用抗原抗体反应进行特异性检测 SDS PAGE依据 蛋白质分子量的差异 1 SDS使蛋白质带有大量负电荷 2 SDS 巯基乙醇作用下 结构松散 二硫键打开 StackingGel SeparatingGel interface Tris glycinebuffer PH8 3 Tris glycinebuffer PH8 3 Samplewithloadingbuffer Tris HCl PH6 8 PH8 8 1 分离 1 制胶1 琼脂糖封底装配电泳槽灌注分离胶灌注浓缩胶 2 样品处理 3 电泳 2 转移 3 免疫学检测 封闭过夜一抗37 C1h洗3次二抗37 C1h洗3次底物显色5 15分钟ddH2O洗涤 4 结果 10 分离胶 ddH2O5 9ml30 丙烯酰胺5 0ml1 5mMTris PH8 8 3 8ml10 SDS0 15ml10 过硫酸铵0 15mlTEMED0 01ml 15ml 5 浓缩胶 ddH2O3 4ml30 丙烯酰胺0 83ml1 0mMTris PH6 8 0 63ml10 SDS0 05ml10 过硫酸铵0 05mlTEMED0 01ml 5ml 凝胶 NC膜 转移 试剂原理 SDS 巯基乙醇 2 ME 强还原剂 AP 化学聚合的催化剂 TEMED 加速剂 PAGE 以单体和双体丙烯酰胺为材料 在催化剂和加速剂作用下 聚合联接而形成的三维网状结构物质 浓缩胶 主要是使样品在进入分离胶前被浓缩成很窄的圆盘状 从而提高分离的分辨程度 分离胶 被浓缩的盘状样品区带进入此胶内 根据各组分的分子量和电荷的不同而被分开 SDS PAGE将洗净 干燥玻璃片嵌入塑胶凹槽中 用经电极缓冲液配制的1 的琼脂糖溶液将狭缝口封住 既不漏胶 又可作为盐桥 待琼脂糖凝固后 将玻板连同胶带凹槽安装在电泳模具上 依次 用力均匀地拎紧螺栓 配制分离胶 依次混合各成分 一旦加入TEMED 马上开始聚合 故应快速旋动混合物 混匀后 倒入玻片之间的空隙 注意不要产生气泡 加至离顶部约3cm处 用吸管覆加一层蒸馏水 防止氧气抑制聚合及保持界面水平 待20 30min后 可看到出现界面 表示已凝固 配制浓缩胶 离顶部约1cm时 即插入加样梳 注意避免混入气泡 约20 30min凝固 将含有SDS DTT的样品缓冲液与样品液 健康者血浆1 10 1 1混合后 沸水煮5 10min 置于冰上 防止复性 加样20 l 孔 最好在所有剩余的孔中加上等体积的1xSDS加样缓冲液 电泳 下槽 上槽 100v 4 5h 转移电泳凝胶电泳结束前30min 将PVDF膜先浸泡在甲醇中 再浸泡在转移缓冲液中 在转移模具上由下至上依次放入 若干张3mm滤纸 PVDF膜 凝胶 滤纸 注意逐层驱除气泡 用玻棒或移液管 连接电极 膜 凝胶 接通电源 20 30v 45min 免疫学检测 Block 1 BSAor5 milkinTBS T overnight Wash PBS Tween3x5min AbIncubation HRP标记的羊抗人IgG 效价随实际调整 也可用打点法决定最佳效价 370c 1h