微生物遗传与分子生物学

精选文库微生物遗传与分子生物学（5*15+1*25=100分）本课程主要涉及到微生物中主要的模式菌株:原核微生物: 放线菌(链霉菌),大肠杆菌,芽孢杆菌,乳酸菌，古菌等。真核微生物：汉逊酵母，酿酒酵母，白念珠菌等。第1章 概论基因的符号：每个基因：如色氨酸基因trp；同一表型的不同基因：如trpA或trpB等。当染色体上发生缺失时可用表示（如trpA或trpA）；基因突变：如亮氨酸缺陷型leu-；抗药性基因：r表示抗性，加s表示敏感如链霉素抗性基因表示为strr，敏感基因表示为strs。1、 微生物基因突变一般分几种类型,突变有什么生物学意义?（谭老师）基因突变可从突变发生方式和突变引起的表型改变和遗传物质改变等方面进行分类。按突变体表型特征的不同，可把突变分为以下4个类型:1). 形态突变型2). 生化突变型3). 致死突变型:按突变所引起的遗传信息的改变，又可把突变分为：1). 错义突变 2). 同义突变3). 无义突变 根据遗传物质的结构改变，可分为碱基置换、移码、DNA片段插入和缺失。根据突变发生的方式，可分为自发突变和诱发突变。突变的生物学意义：基因突变导致了基因表达出来的性状发生了改变，对突变个体本身来讲，绝大多数是有害的，因为现有的生物基本上都适应了现在的环境。但是环境是可变的，如果生物不变，那就很可能被淘汰。所以，对整个生物群体来说，突变使群体不会灭亡。环境不断改变，生物通过不断突变而适应, 也就使其被保存下来。最终，物种的面貌特征与祖先不同，所以说，突变是生物进化的内因，是进化的主要动力。 无数事实说明了一个真理，即宇宙间的所有物种变是绝对的，不变则是相对的。2、 应用于链霉菌基因组编辑与大片段DNA克隆的技术都有哪些？能否用在你们今后的实验中？（刘钢老师） 基因组编辑是指在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。原理是构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切断DNA，切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变，从而达到改造基因组的目的。链霉菌基因组编辑有：l I-SecI endonuclease介导的同源重组系统：敲除质粒上含有一串联的与靶片段左右臂同源的两个DNA片段以及I-SecI识别的18个碱基的位点（sceS）。将该质粒导入链霉菌细胞，并通过抗性筛选质粒插入到基因组上的克隆。如果发生同源单交换，该质粒将被完整导入基因组靶位点。通过诱导表达SecI，SecI在18个碱基的位点（sceS）切断基因组DNA，菌体不能够存活。如果发生同源双交换， sceS被删除，即使诱导表达SecI也不会造成基因组DNA的断裂，菌体仍然存活，并表现出抗性敏感。l CRISPR-Cas9介导的同源重组系统：首先优化cas9的密码子，将其放置在强启动子之后并克隆到敲除质粒上，敲除质粒上含有sgRNA并置于组成型启动子之后， sgRNA中的引导序列为靶位点的同源序列，敲除质粒必须包括靶基因两侧的同源臂。将该质粒导入链霉菌，CRISPR/Cas9系统将靶位点切断，同时质粒上的同源臂与基因组上的同源臂发生双交换，将断裂的靶基因区删除，基因组重新连接。（CRISPR/Cas9系统先切断靶序列后直接发生双交换，最后断裂的靶基因直接被敲除）l 位点特异性整合酶介导的基因组编辑：（cre/lox系统）利用两次同源单交换分别将两个loxP位点整合到目的基因片段的上下游，再将Cre蛋白表达质粒导入链霉菌，在Cre蛋白的作用下，两个loxP位点发生位点特异性重组，完成目的基因片段的敲除。而环化的DNA由于不能在链霉菌中复制，随着传代而丢失。大片段DNA克隆的技术：l 依赖于酵母菌的转化介导的大片段DNA重组克隆（TAR）l 基于FBT1 attp-attB-int整合系统的链霉菌基因组DNA大片段克隆技术：通过结合转移将质粒pSV:attB6Up导入链霉菌，卡那霉素筛选获得pSV:attB6Up同源整合到目的位置的菌株S-attB6。再将pKC1139:attP6Dn导入S-attB6，在40度培养， pKC1139:attP6Dn通过同源单交换整合到目的位置获得S-attB6P6。通过结合转移将含有FBT1整合酶的pIJ10500导入S-attB6P6中，利用整合酶将目的基因簇环出，并克隆到载体pKC1139上。在今后的实验中可能会用到： 我们实验室是分子生物学实验室，这些技术方法对于我今后的研究室有助益的。我们平时多采用基本的遗传操作，构建敲除质粒载体，然后导入受体菌株进行同源重组进行单交换，利用抗生素进行筛选，随后还需要进行双交换。我们可以考虑使用基因编辑技术来进行遗传操做。比如应用CRISPR-Cas9介导的同源重组基因编辑技术来使之直接发生双交换而直接敲除靶标基因，这样操作起来并不繁琐，也省去了些过程，并且对是否发生双交换也比较好判断。3、 作为丝状细菌的链霉菌经历一个怎样的分化过程？对其自身有何意义？（刘钢老师）作为丝状细菌链霉菌的分化过程为：1，孢子萌发形成基质菌丝；2，基质菌丝延伸、分枝；（光秃表型）3，向空气中生长形成气生菌丝；4，气生菌丝产生螺旋和分隔；（白表型）5，分隔加深形成孢子链；6，孢子链变灰，成熟；（灰表型）7，释放游离孢子。 链霉菌的发育分化过程中有部分的基质菌丝和未分化成为孢子的气生菌丝存在有死亡现象，这些菌丝的死亡发生在链霉菌分化过程中的特定时间和区域。，首先是死亡的菌丝体并未显示出PCD所特有的表观特征，其次是死亡的菌丝体并未完全消失，保留的残体既可以作为机械支撑用于气生菌丝分化从而脱离培养基表面，同时也可作为水分和营养物质的运输通道。 对其自身的意义：营养生长阶段，基质菌丝经过顶端生长和分支，在感受到环境中的营养限制或者其他压力后，以应对环境胁迫，链霉菌通过bld基因级联信号通路产生疏水分子SapB，从而赋予菌丝表面疏水特性而使其突破培养基表面的气-水张力进入繁殖性的气生菌丝阶段，然后又通过whi基因等的级联信号通路控制下产生孢子，孢子成熟后飘落到适宜的环境中在进行上述过程生活。这种分化过程可以赋予链霉菌抵御环境胁迫的能力。进行生殖生长产生气生菌丝和孢子，成熟孢子随风或其他生物带到更加适宜其生活的环境中，对于链霉菌自身是十分重要的生活方式，使之区别物其他的原核生物，所以这种发育分化过程对于链霉菌自身意义重大。链霉菌发育分化中的细胞死亡过程其生理学意义可能在于：当链霉菌在生长过程中感受到环境中的营养限制或者其它压力时，通过细胞死亡可为其孢子形成提供营养物质，伴随着基质菌丝向气生菌丝的转变，链霉菌通常会在这一时期产生抗生素，这对于链霉菌专一性的重新利用自身裂解产物可能具有重要的意义。链霉菌发育分化和次级代谢产物的合成一般都是起始于对环境中营养匮乏的感应。4、 链霉菌为什么会产生如此多样性的次级代谢产物？他们对链霉菌本身有何意义？（刘钢老师） 次级代谢产物通常是指不是生物体生长发育所必需的分子量小于3KDa的小分子物质。越来越多的证据表明，次级代谢实际上参与了生物体对环境因子应答等多种生理作用。广泛意义上的抗生素囊括了几乎所有的微生物次级代谢产物，这些次级代谢产物在极低的浓度在生化水平调控微生物的生长过程。 抗生素是逐步合成的代谢产物, 每一步都需要约10 一30 个基因来决定其结构和起自我保护作用抗性基因, 以及控制结构基因活性的调控基因, 并使它们随特性生存需要给予表达; 这常常与活性营养生长和抱子形成之间的转变相一致。链霉菌产生的次级代谢产物对其本身的意义：当链霉菌在生长过程中感受到环境中的营养限制或者其它压力时，伴随着由基质菌丝形成气生菌丝，菌体周围的营养物质逐渐被消耗，链霉菌开始降解自身的基质菌丝为形成繁殖型的气生菌丝提供营养，同时各种次级代谢产物（抗生素）开始产生，而次级代谢产物可以帮助链霉菌抵御环境胁迫，从而创造利于自身生活的环境。这对于链霉菌专一性的重新利用自身裂解产物可能具有重要的意义。这些次级代谢产物在极低的浓度下，可以在生化水平调控微生物的生长过程对菌体的生长也具有重要的生物学意义。抗生素还具有抑制它种微生物生长活动、甚至杀灭它种微生物的能力，这就为链霉菌的生活创造了相对较好的条件。5、 调控基因在抗生素生物合成中有何主要功能？ 抗生素生物合成基因簇一般由调控基因、结构基因和相关抗性基因组成，而且这些基因总是成簇排列。在抗生素生物合成中调控基因起到了一个开关的作用, 它可决定一种抗生素能否被合成、什么时候合成和什么时候被终止的精细调控作用。1. 抗生素生物合成的途径特异性调控：链霉菌的次级代谢产物生物合成基因簇通常成簇排列，包括一个或多个调控基因，一般只负责调控所在基因簇基因表达的调控称之为途径特异性调控。途径特异性调控蛋白如SARP蛋白，SARP蛋白都含有OmpR类的DNA结合结构域和转录激活结构域，通过招募RNA聚合酶到靶基因的启动子上游激活基因的转录。大多数SARP蛋白都是途径特异性调控子，一般只调控与其相邻的基因。2. 全局性调控：相对于链霉菌次级代谢中的其他调控模式而言，全局调控是一种更为多样、普遍、复杂的调控模式。全局调控基因可以调控多条次级代谢途径。全局性调控蛋白对抗生素生物合成的调控通常是通过直接或间接地调控途径特异性调控蛋白实施的。而除了调控次级代谢产物的生物合成外，很多全局调控蛋白还控制着链霉菌的形态分化，还有一些能够调控初级代谢，并成为初级代谢向次级代谢转换的媒介。Eg. 双组份信号转导系统、AdpA3. 抗生素生物合成的自调控-反馈调控和前馈调馈：（抗生素介导的自调控）反馈调控: 指一种微生物代谢反应的终产物在代谢合成过程中对合成基因簇中调控基因或生化反应关键酶基因的调控 (如抗生素)。前馈调控：指一种微生物代谢反应的底物或中间物在代谢合成过程中对合成基因簇中调控基因或生化反应关键酶基因的调控。l 抗生素作为终产物介导的自调控系统可取代双组分系统中通过磷酸化作用的应答调控机制，并证明这种新调控机制在微生物次级代谢生物合成中是广泛存在的。6、 链霉菌信号分子有哪几种类型, GBL类型的信号分子在抗生素生物合成中如何发挥其功能? 菌群群体反应感应信号分子-当信号分子达到阈值-启动特定基因表达-改变和协调细胞间行为使群体呈现某种生理特征。链霉菌信号分子的类型：高丝氨酸内酯(HSL)、自诱导肽(AIP)、AI-2、-丁酸内酯(GBL)、DSF、PQS、法尼醇等。目前研究得最多的群体感应系统有以下四种：革兰氏阴性菌中的酰基高丝氨酸内酯(AHL)介导的群体感应系统、革兰氏阳性菌中的自诱导肽(AIP)介导的群体感应系统、呋喃硼酸二酯结构的AI-2介导的种间群体感应系统和-丁酸内酯(GBL)介导的群体感应系统。GBL类型的信号分子在抗生素生物合成中发挥功能：链霉菌广泛使用-丁酸内酯（GBL）类化合物作为自调控因子。GBL在胞内合成并分泌到胞外，当达到一定阈值浓度时，能够被胞内的受体蛋白所感知，从而引起群体反应(抗生素合成或产孢)。信号分子（A因子GBL）的受体蛋白ArpA与多效调空基因adpA的启动子区结合, 阻遏了adpA的转录。当A因子（GBL）积累到阈值时，它与ArpA结合，使ArpA从adpA上解离，导致adpA有效地进行转录。翻译后的AdpA控制链霉素生物合成基因簇中调控基因strR的转录, StrR激活strB1开始的这个转录单元的基因转录, 从而调控链霉素的生物合成。7、 有哪些方法或策略可以得到新型抗生素?1. 更多链霉菌基因组的测序及挖掘：随着更多链霉菌基因组的不断完成和信息积累, 为抗生素生物合成基因簇的研究，发现新型抗生素提供了重要的条件。大量的链霉菌尚未测序，这极大地影响了新型抗生素的发现。每个基因组平均含有20-30个左右次级代谢产物生物合成基因簇，大多数是未知的，这将是发现新型抗生素的庞大资源。2. 培养条件的优化：微生物只能在适合的条件下生长和繁殖。不同的营养（如不同的碳源和氮源等）条件导致不同的生理代谢。次级代谢产物的生物合成是与前体的提供和相关因子的诱导密切相关的。同时，相关菌株的共同培养可以提供互补的重要物质和信息交流，这为隐性次级代谢基因簇的激活提供了可能的条件。3. 调控子的遗传操作：隐性次级代谢基因簇在受阻遏和缺乏激活因子的情况下不能得到表达，去除负调控基因的阻遏和构建正调控基因的有效表达是激活隐性次级代谢基因簇表达的策略之一。此外，对转录单元中启动子的替换和定向改造也是隐性次级代谢基因簇激活的有效方法。4. 基因簇的异源表达：为了消除菌株本身的一些限制因素，进行隐性次级代谢基因簇的异源表达也是值得尝试的方法。5. 信号分子介导的激活：-丁酸内酯（GBL）作为放线菌的信号分子，通过与相应的受体蛋白相互作用，进而激活多种次级代谢产物的生物合成。除GBL外, 在抗生素生物合成中信号分子具有多样性和多效性, 如抗生素本身可作为信号分子, ATP和肌醇等可作为信号分子参与抗生素的生物合成和形态分化的分子调控。发现新信号分子，研究其在抗生素产生和种间交流中的作用机制；同时可用于激活隐性基因簇；探索抗生素作为信号分子在自然生境中的生物学功能。6. 核糖体工程：在链霉菌中，核糖体蛋白S12的突变同样可以影响抗生素的产量。7. 其他新方法和策略未来可能的突破：以链霉菌为模式，进一步阐明抗生素生物合成与调控机制，为提高重要抗生素的产量乃至激活隐基因簇，挖掘新型活性次级代谢产物方面做出创新性的研究成果 ；深入开展抗生素的组合生物合成和合成生物学的研究，突破天然产物合成过程中的瓶颈，获得在结构和功能上具有突出特点的新型活性化合物。第四章 大肠杆菌 芽孢杆菌 棒杆菌 乳酸菌8、 结合大肠杆菌（致病和非致病）的细胞结构特征及其生物大分子的生物合成规律，简述若干种药物研发的策略。1、药物研发策略：生产某种物质，综合策略： 拓展底物利用能力和范围（“进”） 加快产物转到胞外（“出”） 加强目标合成酶活性（“加”） 减少分支合成途径（“减”） 引入新的合成途径，或延伸已有途径（“增”） 改善细胞的耐受性定向遗传修饰利用大肠杆菌合成相关药物：A、 大肠杆菌产生蛋白类药物 ：优先选用的蛋白药物表达宿主，即利用上述的策略来进行定向遗传改造而合成蛋白类药物。首先，利用大肠杆菌细胞内的内源质粒，构建包含有目标蛋白质的基因的质粒载体，也可以将其导入到大肠杆菌中通过同源重组过程整合到其染色体上进行稳定表达。我们可以改进大肠杆菌的分泌系统，从而加速其产生的生物大分子蛋白质排除体外的效率。从而合成生物大分子蛋白质类药物。B、 大肠杆菌细胞高产抗癌药物前体-紫杉醇(taxol)前体taxadiene。Taxol是萜类化合物（三环二萜），含异戊二烯类单元。天然的大肠杆菌的MEP途径可合成其中2个前体异戊烯焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）。因此，上游模块：增加整个MEP途径的拷贝数；在染色体中引入T7 RNA 聚合酶，并在限速酶前引入T7启动子；通过不同质粒的引入和改变启动子强度来协调不同基因的拷贝数以及表达量；将合成酶基因整合到染色体上，减小代谢负担。下游模块：改变GGPS和TS两个合成基因的顺序；通过启动子更换以及改造，协调基因的表达量；去除代谢抑制子indole。多位点协调上下游两个模块，使前体生物大分子taxadiene的产量提高了约15000倍，达到1.0 g/L 。C、辅因子工程：降低细胞内的能量水平能显著提高酵解速度。ATP, NADH/NAD+, NADPH/NADP+等辅因子参与很多重要胞内代谢过程，其水平及比例可导致微生物代谢及生理发生全局变化。与生物大分子的合成相关， NADPH/NADP+增加有利于生物大分子的合成。厌氧高产正丁醇 还原力驱动：产生1*丁醇需要4*还原力改造方法：敲除3个消耗NADH的途径，使NADH的含量为4； 敲除产生乙酸的途径，节约了1分子前体乙酰辅酶A。综合改造后生物大分子的产量提高了100多倍。作用于致病大肠杆菌的药物的研发：D、外排泵的抑制子作为潜在的药物靶标：TetR类抑制子控制本底水平的外排泵AcrA和AcrB的表达； AraC类的激活子能解除TetR的抑制，使外排泵大量表达； MarR类的抑制子能够抑制AraC的转录，间接影响外排泵表达。抗生素或小分子与抑制子结合，减弱其与靶标DNA的结合，从而解除其对激活子抑制作用，进而促进下游外排泵的高表达。从以上的外排泵的调控方式可以知道，抑制子能够减弱外排泵的表达，从而降低菌株对药物的耐受性，使其容易被杀死。例如，筛选能够结合抑制子RamR的小分子（药物），使其对激活子RamA的抑制作用加强，从而降低外排泵的表达而降低细菌的抗性。由RamR和小分子复合物结构发现关键残基Phe155，从而有助于筛选与其结合的潜在药物。D、转肽酶：这些酶大多是药物的潜在作用靶点，对其结构-功能的研究是热点。例如，青霉素可以竞争结合转肽酶，导致肽桥不能形成而抑制 细胞生长。从而可以筛选其他可以与转肽酶结合的药物来开发新药物。E、抗生素作用的靶标或抗性菌株突变的位点：例如，万古霉素作用位点为双丙氨酰，抑制细胞壁的合成 而其对应的耐药菌株末尾的丙氨酸突变为乳酸。 2、细胞结构特征：细胞内没有成形的细胞核；含有质粒；基因组或质粒上含有“致病岛” 它是一段特殊的DNA片段，包含毒素分泌系统，粘附素等，能够在菌株和相近种之间转移。大肠杆菌大部分是无害的，与宿主互利共生。部分通过获得毒素因子适应新环境或导致疾病。含有由肽聚糖组成的细胞壁；只含有核糖体简单的细胞器；革兰氏阴性(G-)短杆菌, 两端钝圆；大小1.0 1.5 m 2.0 6.0 m；周身鞭毛，能运动，有菌毛。毒性因子：菌毛：大多由质粒编码，成束状，起粘附宿主作用。肠毒素：外毒素，分为耐热和不耐热。 耐热型：免疫原性弱，100, 20 min不破坏； 不耐热型：免疫原性强， 65, 30 min破坏； 类脂A：内毒素，热稳定（ 100, 1 h不破坏）。荚膜多糖：抗吞噬作用3、大肠杆菌生物大分子的生物合成规律：l 生物大分子主要是指蛋白质、核酸以及高相对分子量的碳氢化合物。与低相对分子量的生物有机化合物相比，生物大分子具有更高级的物质群。它们是由低相对分子量的有机化合物经过聚合而成的多分子体系。从化学结构而言，蛋白质是由-L-氨基酸脱水缩合而成的；核酸是由嘌呤和嘧啶碱基与糖D-核糖或2-脱氧-D-核糖、磷酸脱水缩合而成；多糖是由单糖脱水缩合而成。由此可知,由低相对分子量的生物有机化合物变为生物大分子的化学反应都是脱水缩合反应。l 生物大分子合成前相应基本结构单元需要活化，活化后的分子具有高能量，便于后续合成反应。Eg. 以葡萄糖为原料合成糖原时需要经UTP活化为UDPG，以乙酰-CoA为原料合成脂肪酸需要ACP活化为丙二酰-CoA，以氨基酸为原料合成蛋白质时需tRNA活化为氨酰-tRNA，以核苷酸或脱氧核糖核氨酸（NMP,dNMP）为原料合成核酸时活化为核苷三磷酸(NTP,dNTP)。l 生物大分子的合成都需要酶，都需要温和的反应条件。9、 Bacillus cereus group的概念，包括哪些种？简述种内间的联系与区别。Bacillus cereus group均为能够形成孢子的菌株，基因及基因组序列数据显示其种间密切相关，即染色体具有很高的的相似性和共线性，甚至被认为属于相同的种，其包含6个不同的种：1) B. cereus sensu stricto: 狭义的蜡状芽孢杆菌，广泛存在于土壤中，能引起食品污染，导致人类呕吐和腹泻，并且有些菌株能引起软组织感染的机会致病菌。2) B. anthracis: 可引起炭疽热，被用于生物武器； 3) B. thuringiensis: 能产生杀虫晶体蛋白，被用作重要的微生物杀虫剂； 4) B. mycoides: 腐生细菌，能够形成根状菌落； 5) B. pseudomycoides与B. weihenstephanensis: 放射状的菌落形态，脂肪酸的组成与群中其他菌不同； 6) B. cytotoxicus: 最新从蜡状芽孢杆菌中分离出来，主要与食物中毒有关，在系统发育关系上与蜡状芽孢杆菌群里其他成员较远。Bacillus cereus group种间联系与区分： 虽然Bacillus cereus group种间染色体具有很高的相似性和共线性，但是其包含几百个菌株，也显示了很高的基因异质性及菌株特异的基因组适应性，比如有些蜡状芽胞杆菌具有跟炭疽芽胞杆菌类似的特征，包括其致病性，但是并不含有与后者完全一样的质粒。 蜡状芽孢杆菌群种间的区分依据： 一般蜡状芽胞杆菌群不同种之间的主要区分标志是其表型，特别是对于B. cereus sensu stricto，B. anthracis，B. thuringiensis，这些表型的差异往往由位于质粒上的遗传物质所决定： a. 炭疽芽孢杆菌引起炭疽热的毒力因子基因主要位于两个大质粒上，pXO1和pXO2，这两个质粒对于炭疽芽胞杆菌的致病至关重要,也是其区别于其他成员的主要特征。a. 苏云金芽胞杆菌主要特征是在芽胞形成的同时产生伴胞晶体即-内毒素,而编码这些晶体蛋白的基因主要位于质粒上。b. 蜡状芽胞杆菌合成呕吐毒素的基因位于一个大质粒上。 c. B. cereus group中的质粒：1) 是非常重要的形态因子，如B. thuringiensis的晶体毒蛋白基因与B. anthracis的炭疽毒素基因均位于质粒元件上。2) B. cereus group中，质粒普遍存在，单个菌种可能含有6个不同的质粒。3) 质粒大小变化也很大，从2kb到大于600kb，且不同菌株的质粒谱型并不总与其系统发育相匹配。4) 在B. cereus群的进化过程中，质粒是染色体的延伸，质粒和染色体之间基因交换频繁，有利于菌株得以生存于不同的多变的环境之中。10、 在芽孢杆菌生物膜形成过程中，最主要的抑制子是什么？简述其是如何被解除并促进生物膜的形成的。形成生物膜是芽孢杆菌在自然环境中形成有利条件维持生存的一种群体性行。生物膜形成过程中的最主要抑制子：SinR，它是一个转录调控子，可以抑制基质形成基因的表达，也可以促进细胞运动相关基因的表达，因此形成生物膜需抑制SinR蛋白的表达。破解并促进生物膜形成的过程：抗阻遏蛋白SinI可拮抗SinR活性。通过对环境的感知，芽孢杆菌种控制孢子形成的双组份信号转导途径中磷酸化的应答调控蛋白（RR）转录调控子Spo0A可以激活SinI基因表达，从而产生抗阻遏蛋白SinI，通过与SinR的结合来降低SinR浓度，从而使细胞丧失运动性而形成细胞链并产生基质，刺激感受态形成，最终促进生物膜的形成。11、 简述芽孢杆菌感受态形成过程中关键调控子ComK的作用（降解及释放的过程）。 感受态的形成主要包括三个过程：群感效应系统，主要调控子ComK的激活，ComK激活下游感受态相关基因。在B. subtilis感受态形成过程中DNA结合、摄取及重组相关基因的转录都是受到感受态调控子ComK的调控，ComK直接或间接调控的基因多达100个。1 ComK的自激活循环ComK的自激活循环是形成感受态的关键步骤，ComK以二聚体组成的四聚物形式结合于各启动子上，激活下游基因转录，包括自身基因。2 ComK的抑制： ComK在自激活循环后，转录被激活并翻译ComK，但是合成的ComK与MecA结合， MecA募集ComK结合到蛋白酶ClpCP，使ComK被降解，从而无法调控感受态的形成。3 ComK的释放： 群感效应信号分子ComX及CSF可以促使ComAP的水平升高， ComAP能够促进表面活性素surfactin基因簇的转录，而位于此基因簇上的comS同时被转录。ComS是46个氨基酸的小肽，可以与MecA结合使ComK从ComK / MecA /ClpC复合物上释放，而ComS及MecA被ClpCP降解。 4 ComK激活下游基因：当ComK浓度足够高，ComK可激活DNA摄取基因（comC,-E,-G,-F)、DNA整合基因（recA，addAB）及自身基因comk的表达。综上所述，ComK在感受态的形成过程中起到了承上启下的作用。12、 简述纳豆激酶产品开发的实验设计思路。纳豆激酶(NK)是芽孢杆菌分泌酶: 可溶解血纤维蛋白，有显著的溶栓的作用，具有广阔的开发前景。通过枯草芽孢杆菌培养，利用(NH4)2SO4沉淀、Sephadex G100柱层析对该酶发酵液进行分离纯化，已经分离纯化出了枯草芽孢杆菌溶栓酶。 纳豆激酶产品开发实验设计思路：纳豆激酶的产品开发是以纳豆为原料，接种纳豆芽孢杆菌，对其进行发酵，分离纯化而得到的。纳豆激酶的分离纯化粗提方法即是将发酵液或纳豆浸提液离心取上清，用硫酸铵或乙醇沉淀，再经离心除去上清液中的粘性物质，离心后取沉淀，溶于缓冲液中即为粗酶液。随后将粗酶液进行精提，将粗酶液进行脱盐，离子交换，柱层析，透析，最后冷冻干燥制得酶干粉。可以利用分子生物学技术在L.lactis中表达纳豆激酶：这种方式大大加快了纳豆激酶的生产效率。在乳酸菌中表达 nisK/R（纳豆激酶基因）, 目的基因用nisA 启动子控制，在nisin作为诱导物诱导时目的基因表达。这个诱导表达系统称为NICE系统。此系统可严谨控制、高效表达，是很成熟的乳酸菌外源基因表达系统。Nisin是食品级的安全诱导物，可直接应用的食品中；少量nisin即可诱导外源基因的表达。 首先，构建含有纳豆激酶基因的质粒载体，将质粒载体导入到L.lactis中，在培养液中加入淡豆豉，诱导纳豆激酶的表达。最后优化培养条件，最终得到商品化的纳豆激酶产品。最终，纳豆激酶的分离纯化过程比较繁琐，但目前并没有特别简易的方法，有研究者研究过以下方法：盐析法分离提纯纳豆激酶，超滤法分离提纯纳豆激酶等，但我觉得这些方法就目前的研究水平还不适合大规模生产的应用。13、 B. subtilis分泌蛋白有哪4种不同途径，简述每种途径分泌蛋白过程及所分泌蛋白特点。B. subtilis分泌蛋白有四种不同途径蛋白特点及分泌过程： l Sec-SRP cooperation pathway: 绝大多数蛋白通过Sec-SRP 途径运输；转运未折叠的蛋白质。 B. subtilis中最主要的蛋白质分泌途径，可以分为3个功能阶段：蛋白定位：分泌蛋白首先由核糖体合成前体，前体蛋白在N-端含有信号肽；细胞质分子伴侣可以帮助前体蛋白保持能够被迁移的状态； SRP与信号肽相互识别，将前体定位于膜上的Sec易位酶复合物。蛋白易位：信号肽带正电荷的N-domain与膜上负电荷的磷脂相互作用，导致H-domain弯曲地插入膜上，当H-domain变直之后，前体蛋白的第一部分被拉至胞外。蛋白的折叠及释放：在易位过程中或易位之后的瞬间，信号肽被type I Spases切除，使成熟肽从Sec易位酶复合物上释放；最后，胞外分子伴侣参与分泌蛋白的折叠及质量控制。l twin-arginine translocation (Tat)pathway: 相较于Sec-SRP 途径，Tat 途径可以从B.subtilis的细胞质转运紧密折叠的蛋白甚至多聚酶复合物到培养基中。分泌蛋白至培养基、细胞壁及插入蛋白至细胞质膜。Tat 途径的信号肽：转运已折叠好的蛋白。Tat 途径的蛋白分泌过程：具有RR/KR类型信号肽的前体蛋白在易位之前可以在辅因子的帮助下在细胞质中折叠； 前体蛋白可以通过Tat蛋白复合物(Tat易位酶)组成的通道而穿过细胞质膜； 在转运的过程中，经过信号肽酶和细胞壁通道的加工，折叠的成熟蛋白分泌至培养基中。l ATP-binding cassette (ABC) transporters: 在真核、原核生物中发现，既可输出也可输入各种分子，如离子、氨基酸、肽、抗生素、多糖及蛋白质等。1) 与核糖体合成的羊毛硫细菌素(lantibiotics)和信息素(pheromone)合成有关2) lantibiotics or pheromones的信号肽叫做前导肽，lantibiotics的前导肽大概有23-30个氨基酸残基，与lantibiotics的翻译后修饰有关。l pseudopilin export pathway: 感受态形成相关。假菌毛蛋白通过Com系统运输。14、 Bt菌株在孢子形成期及营养生长期分别形成哪些不同的杀虫毒素，简述Cry蛋白杀虫机制。Bt 在生长代谢过程中可产生多种对昆虫有致病性的杀虫毒素： l 在孢子形成开始和稳定生长期：Bt菌株合成 Cry和 Cyt 毒素，即-内毒素或伴孢晶体毒素； l 在营养生长期：Bt 菌株也可以合成其他的杀虫蛋白，这些蛋白会被分泌至培养基中，并被定义为Vip和Sip。Vip与Sip毒素都显示了对一些鞘翅目昆虫的杀虫活性。Cry（伴孢晶体）蛋白杀虫机制：孔洞形成模型Step1：在碱性的昆虫幼虫中肠，可溶的非活性复合物Cry1A被蛋白酶消化，形成活性的蛋白酶抗性的三域结构的单体； Step2: Cry1A低亲和力、大量地结合被GPI锚定受体锚定在膜脂上的APN和ALP受体，这种结合方式促进了活性toxins定位与富集；Step3-4：与钙粘素受体的结合促进了N-末端helix 1的蛋白切除； Step5：N-末端的切除诱导了前孔洞寡聚物的形成并且增强了寡聚物与GPI锚定在膜脂上的APN和ALP受体的亲和力； Step6：寡聚物插入细胞膜，导致孔洞形成与细胞裂解。最终使害虫无法存活，达到杀虫的目的。15、 结合谷氨酸棒杆菌中谷氨酸生物合成途径、代谢调控、基因组转录组信息及其对环境的响应机制，阐述提高谷氨酸产量的可能途径或方法。谷氨酸生物合成途径以及代谢途径：谷氨酸生物合成：三羧酸循环中产生-酮戊二酸，当-KGA（ -酮戊二酸）脱氢酶酶活性微弱或丧失时， -酮戊二酸会在NADPH和NH4+ 在谷氨酸脱氢酶作用下，合成谷氨酸，而不会生成琥珀酸，脱离三羧酸循环而生成谷氨酸，最后透过细胞膜分泌到胞外。内在因素谷氨酸生产菌的生化特征 l 具有CO2 固定反应的酶系：菌种能利用CO2产生大量草酰乙酸, 有利于谷氨酸大量积累。 l -KGA（ -酮戊二酸）脱氢酶酶活性微弱或丧失：这是菌体生成并积累-KGA的关键。-KGA是菌体进行TCA循环的中间性产物，很快在-KGA脱氢酶的作用下氧化脱羧生成琥珀酸辅酶A，在正常的微生物体内浓度很低，只有当体内-KGA脱氢酶活性很低时，TCA循环才能够减弱，-KGA才得以积累，为谷氨酸的生成奠定物质基础。 l 谷氨酸产生菌体内的NADPH氧化能力欠缺或丧失：NADPH是-KGA还原氨基化生成谷氨酸的必须物质，该还原氨基化所需要的NADPH与柠檬酸氧化脱羧相偶联。 由于NADPH的氧化能力欠缺或丧失，使得体内的NADPH有一定积累，NADPH对于抑制-KGA的脱羧氧化有一定的意义。 l 菌体有强烈的L-谷氨酸脱氢酶活性： L-谷氨酸脱氢酶，谷氨酸产生菌体内该酶的酶活性都很强， - 酮戊二酸易生成谷氨酸。 该反应的关键是与异柠檬酸脱羧氧化相偶联l 产生菌体内乙醛酸循环（DCA）的关键酶异柠檬酸裂解酶：该酶是一种调节酶，或称为别构酶，其活性可以通过某种方式进行调节，通过该酶酶活性的调节来实现DCA循环的封闭，DCA 循环的封闭是实现谷氨酸发酵的首要条件。糖的代谢才能沿着- 酮戊二酸的方向进行, 从而有利于谷氨酸的积累。 外在因素l 供氧浓度过量：NADPH的再氧化能力会加强，使-KGA的还原氨基化受到影响，不利于谷氨酸的生成。供氧不足：积累大量的乳酸，使发酵液的pH值下降，不利于谷氨酸的产生，同时，一部分葡萄糖转成了乳酸，影响了糖酸转化率，降低了产物的提出率。因此当供氧量合适的时候，才有助于谷氨酸的合成，过多或多少都不利于谷氨酸的合成。l NH4+浓度： 影响到发酵液的pH值 与产物的形成有关：NH4+过量，菌体增殖阶段会抑制菌体生长，产酸阶段 Glu会受谷氨酰胺合成酶作用转化为谷氨酰胺（ Gln） NH4+不足，不利于 -KGA的还原氨基化， -酮戊二酸积累，引起反馈调 节。 l 磷酸盐过量： 促进EMP途径，打破EMP与TCA之间的平衡，积累丙酮酸，产生乳酸等； 产生并积累缬氨酸（ Val） 因此，在发酵过程中,要严格控制NH4+ 和磷酸盐的含量 。l 发酵液的碳氮比 ：发酵液中糖含量与谷氨酸的发酵有密切的关系。在一定范围内, 谷氨酸的产量随糖含量的增加而增加, 但糖含量过高, 渗透压过大, 对菌体生长不利, 谷氨酸对糖的转化率低。l 生物素：当生物素过量时,菌体生长繁殖快,谷氨酸合成途径受阻,发酵液中由菌种细胞排出的谷氨酸仅能占氨基酸总量的12%；生物素适量时,菌体代谢失调,细胞膜通透性增强,细胞内的谷氨酸能及时排出,有利于谷氨酸的积累。 因此,要根据发酵时期来控制生物素的含量。l 发酵温度 ：谷氨酸发酵前期应采取菌体生长最适温度,即3032 。 温度过低, 菌体生长繁殖慢;若温度过高,菌体易衰老, 生产中表现为O D值增长慢, 耗糖慢, pH值高, 最终发酵周期长,产酸少。 发酵中、后期菌体生长基本停止, 为积累大量谷氨酸, 应适当提高发酵温度,但温度过高,酶易失活,谷氨酸生成受阻。 l pH值 ：pH值影响谷氨酸产生菌的生长 pH：前期pH（7.5-8.0），中后期pH7.0-7.6。通过采用流加尿素，氨水或液氨等办法调节pH，补充氮源。 l 泡沫 ：谷氨酸发酵是好气性发酵, 因通风和搅拌产生泡沫是正常的, 但泡沫过多会带来一系列问题: (1) 泡沫形成泡盖时, 代谢产生的气体不能及时排出,妨碍菌体呼吸作用,影响菌体的正常代谢; (2) 泡沫过多, 发酵液会外溢,造成浪费和污染; (3) 泡沫过多,易冲上罐顶,造成染菌。因此,在谷氨酸的发酵过程中控制好过多的泡沫是发酵成败的关键。 （也就是说谷氨酸产生菌的主要特征 ：-酮戊二酸氧化能力微弱:；-酮戊二酸脱氢酶丧失或活性低；谷氨酸脱氢酶活性强；还原性辅酶(NADPH+H+)进入呼吸链能力缺陷或微弱；异柠檬酸裂解酶活力微弱；不利用谷氨酸；耐高糖耐高谷氨酸 ；CO2固定能力强； 解除谷氨酸反馈抑制；具有向胞外分泌谷氨酸的能力.） 基因组信息：谷氨酸棒杆菌的碳代谢及氨基酸合成系统构建 ：l 糖吸收 ：PTS系统：葡萄糖、果糖、甘露糖以及蔗糖 果糖摄取的PTS系统相关基因： ptsI-cg2118-pfkB-ptsF-ptsH 葡萄糖、甘露糖、蔗糖相关基因：ptsG、ptsM、ptsSl 碳源的中心代谢系统 ：l 基因成簇：如：gap-pgk-tpippc, aceA-aceB 或 sdhC-sdhA-sdhB l 含多种同工酶 l 含有功能未知酶：如：cg0441和cg0790（假设的硫锌酰胺脱氢酶，cg0949和cg0798（柠檬酸盐合成酶） 生物合成及转运代谢系统的重建 对于利用天冬氨酸盐或丙酮酸盐过量生产L-氨基酸和维生素具有重要作用 。 （进行基因组操作来提高谷氨酸的产量：a. 单基因敲除 ：失去ODHC（酮戊二酸脱氢酶复合体）活性； 无需诱导剂便可产生L-谷氨酸 ；存在诱导剂时产量可增加10% ；通过改变代谢流来增加L-谷氨酸产量 。b. 双基因敲除 ：dtsR1 和 pyc的敲除抑制菌体生长，但可使菌体在无诱导剂的条件下产L-谷氨酸 ；加入生物素，双突变菌株L-谷氨酸产量较野生型提高13.1% ；加入吐温40，双突变菌株L-谷氨酸产量较野生型提高9.8% -吐温40可通过抑制DstR活性使脂肪酸合成降低，进而提高谷氨酸产量。dtsR1 或 pyc 敲除后PEPC活性提高 通过PEPC活性的提高来弥补dtsR1 或 pyc敲除对TCA的损伤。c. 引入外源基因 ：C. glutamicum ATCC14067 (pJCtacvgb)具有较高的氧吸收率，VHb蛋白提高了重组菌的呼吸效率。 发酵罐发酵： 产量提高22%；摇瓶培养： L-谷氨酸的产量提高23%，菌体量提高30% 。）转录组信息：l 调控蛋白（ regulators）：C. glutamicum：158个调控蛋白（ 128个DNA结合转录调控因子, 13个TCS应答蛋白，10个其它调控蛋白以及7个因子），占蛋白编码基因的5.3% 。 DNA结合转录调控因子 ：大部分与DNA结合的转录调控因子是HTH模体，依 据氨基酸序列相似性可分为29个蛋白家族，大部分都参与负调控，抑制可能 是C. glutamicum 主要调控方式。 双组份调控中的应答调控蛋白 ：这些双组份系统在感受传递外界信号、调控 细胞生理活动过程中具重要作用 其它调控基因 ：主要包括：DnaA, CspA, IHF , PhoU, WhiA, LytR以及PyrR 家族，这些蛋白高度保守，如 PyrR在多种细菌中通过与靶基因mRNA上特异 性序列的结合调控嘧啶核苷酸合成基因的表达。 因子 ：主要包括：其中SigH在热和氧的压力调控中具有重要作用，它调 控SigB、WhcE、HspR、ClgR 等基因的表达以及伴侣蛋白的水解 l 转录调控实例：全局转录调节子GlxR GlxR: cAMP-感应蛋白 ；Crp-Fnr 超家族 ；双调节子 ；调控150个基因 ；所有棒杆菌中保守 。参与调控： 芳香化合物的降解 ；有氧及无氧呼吸 ；糖的吸收、酵解及再生 ；谷氨酸盐的吸收及氮的同化 ；醋酸盐、乳酸盐、葡萄糖酸盐、乙醇代谢 ；脂肪酸和脱氧核糖核酸的合成 ；细胞的压力应答及复苏 。因此会影响谷氨酸的生物合成，可以改变适当的条件来提高谷氨酸的产量。谷氨酸棒杆菌对环境响应 ：l 谷氨酸棒杆菌的热激调控网络极为复杂，它不仅上调dnaK、grpE、dnaJ、groES、groEL等分子伴侣编码基因和hsp的表达，还上调或下调300个基因的表达。 l 谷氨酸棒杆菌中还存在对渗透压的信号感知系统 MtrAB系统，来感应渗透压并传递信号，调控胞内基因的表达。MtrAB系统作用：调控细胞壁的合成以及维持高渗环境下细胞内外渗透压的平衡。谷氨酸棒杆菌耐受高渗透压机制：当外界的渗透压较高时，胞内大量的水分流出，使胞内溶质的浓度升高，这种升高的信号会被MtrB识别，并活化MtrA，启动betP的表达， BetP则会启动细胞相容性物质甜菜碱的转运。 l ROS(reactive oxygen species)是微生物在有氧代谢中产生的副产物，过量的ROS会导致氧胁迫和细胞损伤。为了保护微生物免受ROS的损害，微生物在进化过程中形成了一系列的抗氧化系统。l 谷氨酸棒杆菌对冷的应答 l 谷氨酸棒杆菌对酸的应答 ：在中性或低pH时，谷氨酸棒杆菌会因氧化胁迫而受损，氧化胁迫的存在会干扰铁离子的活性，调控谷氨酸棒杆菌的代谢。 在酸性条件下半胱氨酸的积累会抑制谷氨酸棒杆菌的生长 。谷氨酸棒杆菌对pH的应答是个复杂的过程，它与氧化胁迫、铁离子平衡以及新陈代谢相联系。 16、 什么是多位点序列分型技术，简述其在乳酸菌中的应用。多位点序列分型技术（MLST）： 是一种基于核酸序列测定的细菌分型方法，通过PCR扩增610个管家基因内部400600bp核苷酸序列，测定其序列，分析菌株的变异，从而进行分型。与传统分子生物学分型方法相比，MLST操作简单，具有更高的分辨力，能将同种细菌分为更多的亚型，并确定不同序列型之间的系统发育关系以及与疾病的联系。随着测序速度的加快和成本的降低，以及分析软件的发展，MLST逐渐成为细菌的常规分型方法。多位点序列分型技术在乳酸菌中的应用：通过比较ST可以发现菌株的相关性，即密切相关菌株具有相同的ST或仅有极个别基因位点不同的ST，而不相关菌株的ST至少有3个或3个以上基因位点不同。对于已有的成熟MLST方案的细菌，可直接从MLST数据库中获取分型方案。乳酸菌种间同源性较高，部分种或亚种的分类学地位模糊不清，常规分类技术常常很难区分其近缘种或亚种，多位点序列分型技术在细菌分类鉴定中存在明显优势，近些年开始应用于乳酸菌分类鉴定中。17、 简述乳酸菌基因组的特点.乳酸菌基因组的特点 ：l 基因数目差异大：不同乳酸菌种之间基因数目从1600到3000个不等，基因数差异大，表明乳酸菌处于一个动态的进化过程之中，大量的基因发生丢失、重复或者获得新的基因。原因可能是乳酸菌通常生活在丰富的营养环境中,能够直接摄取生长所需要的营养物质，进而促使基因组简化和退化，尤其是糖代谢、摄取和发酵相关的基因的衰退。l 基因组中都含有假基因 ：所有的乳酸菌都含有假基因且数目变化很大，如在肠膜明串珠菌中20个，嗜热链球菌含有200个假基因。假基因数目的差异表明乳酸菌基因组处于一个活跃的退化过程。 l 基因组中有很多插入序列 ：乳酸菌基因组中中含有转座因子插入序列(IS)，大小一般在750-2500bp，数量由格氏乳杆菌基因组的0.2%到乳酸乳球菌乳脂亚种的5%，说明这些菌有较高的遗传可塑性。 18、 简述羊毛硫细菌素的生物合成基因簇的组成及生物合成过程。羊毛硫细菌素的生物合成基因簇的组成：参与羊毛硫细菌素合成的基因一般位于一个基因簇中，簇中基因一般包括羊毛硫细菌素结构基因，修饰基因，转运加工蛋白基因、免疫蛋白基因及调控蛋白基因。 羊毛硫细菌素的生物合成过程：结构基因(LanA)首先通过核糖体合成前体分子（包括N端的前导序列和C端的原肽区）；再经过修饰基因产物(LanBC/LanM）翻译后修饰；在前导肽以及加工转运蛋白（LanP/T）的作用下转运到细胞