转录组测序原理.ppt

转录组测序技术原理 转录本 Alltranscripts AllmRNAs 主要内容 样品检测文库制备ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析 TotalRNA样品检测 Agilent2100检测OD260 280 1 8 2 2RNA28S 18S 1 0 RIN 7 检测报告 合格样品 检测报告 不合格样品 主要内容 样品检测文库制备ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析 第一天 消化DNA mRNA的分离 mRNA的打断 cDNA的合成 第二天 末端修复 加接头 胶回收 3 端加A 第三天 PCR PCR胶回收 文库制备 真核mRNA的纯化 mRNA的纯化主要通过磁珠吸附原理从而分离纯化Oligo dT 25磁珠纯化原理主要是mRNA的3 的polyA与磁珠在bindingbuffer的作用下相结合 磁珠通过MPC 磁分离器 从溶液中分离出来 mRNA与磁珠结合后 再用Tris HCL在加热条件下解离洗脱到溶液中 原核mRNA的纯化 AmbionMICROExpressKit mRNA反转录 纯化过的mRNA样品加入1 l的fragmentbuffer70 作用1 5min 加入1 l的stopbuffer终止反应 加入沉淀剂 NaAc糖原无水乙醇 沉淀酶切产物 末端修复cDNA3 末端加AAdapter连接 不同方法比较 主要内容 样品检测文库制备ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析 主要内容 样品检测文库制备ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析 新一代测序技术 Throughput upto25Gbperday 合成第一个碱基 Cycle1 按顺序加入反应试剂 清除未反应的碱基和试剂 激发碱基荧光并收集荧光信号去除阻断基团和荧光基团 Cycle2 n 重复前面的步骤 基于SBS测序技术 碱基片段杂交 Clusterstation 剩下的复制链其一端 固定 在芯片上 另外一端随机和附近的另外一个引物互补 被 固定 住 形成 桥 bridge 形成的单链桥 以周围的引物为扩增引物 在芯片表面进行扩增 形成双链 双链经变性成单链 再次形成桥 并作为下一轮扩增的模板继续扩增反应 反复若干轮扩增 每个单分子得到了大量扩增 成为单克隆 DNA簇群 主要内容 样品检测文库制备ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析 生物信息分析 基本信息分析 数据量产出 2Gbpersample测序策略 HiSeq2000 PE91or101插入片段大小 200bps测序质量控制 Q20 80 有参考基因组序列生物信息分析 基因结构优化鉴定基因可变剪接预测新转录本SNP分析基因融合鉴定 有参考基因组序列信息分析流程 Reads在基因组上的分布 基因结构优化 Nagalakshmi U etal 2008 通过转录组测序鉴定出酵母3 和5 UTR区域 鉴定基因可变剪接 exon1 exon2 exon3 exon1 exon2 exon3 exon1 exon3 commonreads junctionreads mRNA 鉴定融合基因 新转录本预测 NEngJMed2009 SNP分析 DeepRNAsequencingatsinglebase pairresolutionrevealshighcomplexityofthericetranscriptome GenomeRes2010 RiceTranscriptome Materialcallusrootatseedlingstage 14d shootatseedlingstage 14d flagleaves 2stages panicle 3stages MethodsRNASeq paired end singleend DGEsmallRNA 18 30nt 基因功能注释基因结构分析鉴定出大量新转录本可变剪接鉴定基因融合鉴定 无参考基因组生物信息分析 Unigene功能注释Unigene的GO分类Unigene代谢通路分析预测编码蛋白框 CDS Unigene表达差异分析Unigene在样品间的差异GO分类和Pathway富集性分析 Denovoreads组装流程 UnigeneGO分类 UnigeneCOG功能分类 基因表达差异分析 N1 totaltagNumberinsampleAN2 totaltagNumberinsampleBX GeneexpressionlevelinsampleAy GeneexpressionlevelinsampleBReference AudicS etal Thesignifica