第18章+遗传病的诊断.ppt

第十八章遗传病的诊断 DiagnosisofGeneticDisease 2 概述 遗传病诊断的复杂性及基本要求 病种多 涉及各个临床专科 需要各个学科的密切配合 1 遗传病诊断的方法 1 常规诊断方法 2 特殊诊断方法 遗传学方法 病史采集症状和体征检查实验室检查影像学检查 系谱分析染色体分析生化分析基因诊断肤纹分析 遗传学方法是指针对遗传病特定病因创立的诊断方法 是遗传病确诊的关键 3 2 诊断时间 1 出生前诊断 prenataldiagnosis 2 症状前诊断 presymptomaticdiagnosis 3 临症诊断 symptomaticdiagnosis 出生前诊断和症状前诊断比临症诊断更具意义 4 第一节遗传病的常规诊断一 病史 除一般病史外 应着重了解 1 家族史 家族中同种疾病的发病情况及分布 家族史的作用 可画出系谱图 并结合文献研究资料初步分析该病是否为遗传病及其可能的遗传方式 采集家族史时应注意的问题 注意患者或代述人的文化程度 记忆能力 判断能力和精神状态等是否影响到叙述的准确性和全面性 5 2 婚姻史 婚龄 婚次 配偶健康情况 是否近亲结婚 有助于了解致病基因的来源 3 生育史 生育年龄 推测生育遗传病患儿的可能性大小 子女数目及健康状况 有助于进行系谱分析 有无流产 死产和早产史 推测夫妇是否为异常染色体携带者 有无产伤 窒息 孕早期有无患病毒性疾病和致畸因素接触史 以鉴别患者所罹患的疾病是否为遗传性疾病 6 二 症状和体征 遗传病有与其它疾病相同的症状 也有其本身特异性症候群 可为诊断提供初步线索 例如 智力低下 特殊腐臭尿液 智力低下 白内障 肝硬化等 智力低下 伸舌 眼距宽 眼裂小 外眼角上斜等体征 性腺发育不全 生育力下降 原发性闭经 行为异常 由于遗传病普遍存在遗传异质性 若欲作出病因诊断 必须进行实验室检验 7 第二节遗传病的遗传学诊断 一 系谱分析1 方法或程序 以先证者为线索 调查其家系中某种疾病的分布情况 绘出系谱图 8 2 系谱分析的基本要求 1 分析者必须掌握各遗传病遗传方式的基本规律和相应的系谱特征 2 系谱完整 准确 可靠 有三代以上家庭成员的患病 婚姻及生育情况 3 系谱分析应解决的问题 1 疾病类型 2 遗传方式 3 遗传性质 9 4 系谱分析应注意的问题 1 家系小而选样偏倚现象 2 有些遗传因素使孟德尔式遗传病系谱变得不规律或不典型 AD 基因多效性 迟发性 显性基因不完全外显和表现度的差异 新发生的突变 AR 遗传异质性 如耳聋 XD 女性患者的症状可能比男性症状轻 XR 女性X染色体失活 10 二 染色体分析1 适于染色体分析的疾病 染色体病 2 染色体检查的材料 外周血 绒毛 羊水 脐血 骨髓 活检组织 3 染色体检查的指征 生长迟缓或先天畸形 智力障碍 夫妇之一有染色体异常 家族中已有染色体异常或先天畸形的个体 原因不明的死产 多发性流产 原发性不育 性发育不明等 4 染色体检查的技术 G带 Q带 R带 C带 T带 N带 染色体原位杂交 FISH 11 染色体原位杂交 应用标记的特异性DNA探针与玻片上的染色体或间期核的DNA或RNA杂交 在这些核酸不改变其结构和分布格局的情况下 研究核酸片段的位置 相互关系 因此称为原位杂交 荧光原位杂交 florescenceinsituhybridization FISH 用生物素 地高辛等标记的DNA探针进行原位杂交后 用荧光染料 罗丹明 DAPI FITC等 标记的生物素亲和蛋白和抗亲和蛋白的抗体进行免疫检测和放大 使探针杂交的区域发出荧光 这种原位杂交称为荧光原位杂交 12 人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片 多色荧光原位杂交 FISH 13 三 生化分析 1 适于生化分析的疾病 代谢病 分子病和免疫病等 2 常用材料 体液 活检组织 脱落细胞 3 常用方法 主要依赖各种生化反应和蛋白电泳技术 定性 定量分析生化反应物和基因产物 4 局限性 生化检查要求知道代谢异常的机理或基因产物 要求有相应基因表达产物的体液或细胞 14 15 四 基因诊断 概念 利用分子生物学的技术 检测体内的DNA或RNA结构或表达水平变化 从而对疾病做出诊断的方法 一 基因诊断的常用方法与基本原理1 核酸分子杂交 1 核酸分子杂交的基本原理 双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开 而在条件恢复后又可以碱基配对规律形成双链结构 16 当溶液中的DNA分子被加热至100 或处于高PH PH 13 时 靠碱基互补配对形成的双链分子打开成两条单链 这一过程称为DNA变性 当将溶液降至65 以下 保持一定时间 变性后的DNA单链或任何两条碱基互补的DNA单链可以很容易地再形成双螺旋结构 这一过程叫复性 也叫杂交 核酸分子杂交技术 将一条已知序列的单链核酸片段用放射性核素或其它标记物标记作为探针 去检测 分辨互补的RNA或DNA序列 是目前分子生物学领域中最常用的基本技术之一 17 2 常用核酸分子杂交技术DNA印迹杂交 Southernblot 用特异的DNA探针检测DNA 常常用于克隆基因的酶切图谱的分析 基因组中基因的定性及定量分析 基因突变分析等等 主要过程 酶解和电泳 将被检测的DNA分子用限制性内切酶消化成若干片段 并在琼脂糖凝胶电泳上分离 印迹 经DNA变性处理后 利用虹吸作用将凝胶中单链核苷酸序列片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜等固相支持物上 将探针与待测的互补核酸单链结合 放射自显影分析 将X 胶片置于杂交后的膜上 70 低温曝光适当时间后显影分析 18 RNA印迹杂交 Northernblot 用特异的DNA探针检测RNA 常常用于基因表达的特异性分析和定量分析 实验过程与DNA印迹杂交相同 原位杂交 insituhybridization 用核酸探针 DNA RNA或cDNA探针 与细胞或组织中的核酸进行杂交 来确定被检核酸分子在组织或细胞 以及中期染色体中的定位 这一过程被称为原位杂交 19 斑点印迹杂交 dotblot 将待测的核酸样品点在NC膜上 变性后与标记的探针进行结合反应 经过显色和显影后检测杂交信号的强度 与对照样品比较后确定所测核酸量的高低 20 PCR ASO allele specificoligonucleotide 等位基因特异性寡核苷酸杂交法 适用于已知点突变的检测 需要制备两种探针 一种是正常探针 只与无突变序列互补杂交 另一种是突变的等位基因特异寡核苷酸 ASO 探针 只与突变基因序列稳定杂交 这样 就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区别开来 探针通常为15 20bp 突变位点位于探针序列的中央 严格的杂交洗脱温度可区分探针与靶DNA之间的完全互补与非完全互补 以放射性或非放射性标记后 用斑点杂交或Southern印迹杂交进行检测 21 ASO探针杂交图解 用正常探针杂交 正常个体和携带者显示杂交信号 患者不显示杂交信号 说明患者没有与正常探针完全互补的序列 用突变探针杂交 患者和携带者显示杂交信号 正常个体不显示杂交信号 说明正常人没有与突变探针完全互补的序列 携带者显示两种杂交信号 22 ASO斑点杂交诊断镰状红细胞贫血症 制备正常探针和突变探针 用正常探针杂交 正常者和携带者显示杂交信号 患者不显示信号 用突变探针杂交 携带者和患者显示杂交信号 正常者不显示信号 携带者可同时显示正常探针和突变探针信号 23 用ASO检测PKU 24 基因芯片技术 近年来兴起的基因分析与检测的新技术 具有快速 敏感 高效 平行化 自动化等优点 将发展成新一代基因诊断技术 是将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针 有规律地排列在玻片 硅片或尼龙膜等固相支持物上 通过激光共聚焦荧光显微镜获取信息 电脑系统分析处理所得资料 一次微排列可对上千种甚至更多基因的表达水平 突变和多态性进行快速 准确的检测 可检测基因的结构及其突变 多态性 分析基因的表达情况 按照基因芯片的用途将其分为表达谱芯片 诊断芯片 指纹图谱芯片 测序芯片 毒理芯片等 25 26 2 聚合酶链反应 PolymeraseChainReaction PCR 是依据细胞内DNA复制机理在细胞外扩增DNA片段的技术 反应体系 样品DNA 引物 primer 是人工合成的一对寡核苷酸链 约15 20个核苷酸 4种dNTP TagDNA聚合酶 是从一种嗜热水生菌 Thermusaquaticus 中分离出来的 此酶最适作用温度为75 80 但短时间在95 下不失活 适宜的缓冲体系和适量的Mg2 27 反应步骤 变性 DNA双链解离 92 95 复性 退火 降温退火 使引物与模板结合 40 60 延伸 在引物的引导下合成模板单链的互补链 从而形成DNA双链片段 65 72 重复上述 变性 复性 延伸 的过程 用途 克隆基因 DNA测序 基因结构分析 检测基因表达水平 遗传性疾病及感染性疾病病原体的基因诊断 28 PCR扩增原理 29 3 限制性片断长度多态性 RFLP 分析 1 DNA多态性 等位基因或DNA等位片段存在两种或两种以上形式的现象 按孟德尔共显性方式遗传 可用于连锁分析 基因定位和亲子鉴定 2 RFLP restrictionfragmentlengthpolymorphism DNA碱基序列发生变化可改变限制酶的识别顺序 增加或消除 从而出现或丢失某一限制性酶切位点 使酶切片断长度或数量发生变化 例1 镰形细胞贫血症的基因诊断 直接电泳检测 或做PCR扩增后电泳检测 30 镰形红细胞贫血症的基因诊断图解 用内切酶MstII切割DNA 该酶识别序列CCTNAGG s 1 35kb 1 15kb 0 2kb 567脯缬谷 CCTGTGGAG CCTGAGGAG 脯谷谷 第11号染色体 31 0 2kb 1 15kb 1 35kb 正常人 A A 突变携带着 A s 患者 s s 镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 32 血友病A的基因诊断 探针杂交检测 图1 用两种不同的内切酶和探针组合 检测出不同类型的个体具有不同的DNA序列 33 血友病A的基因诊断 探针杂交检测 图2 探针A是 因子基因1 7kbKpnI的cDNA片段 包括1 12外显子 探针B是 因子基因4 7kbEcoRI的cDNA片段 包括14 25外显子和部分26外显子 待测DNA用BcII和SstI酶切 患者不存在4 4与1 2kb的片段 携带者具有与患者相同的14 5kb的片段 34 5 PCR 单链构象多态性 singlestrandconformationpolymorphism SSCP DNA单链构象多态性 是指等长的单链DNA因核苷酸序列的差别而产生构象差异 在非变性聚丙烯酰胺凝胶中表现为电泳迁移率的差别 将突变所在区域的DNA片段进行PCR扩增后进行电泳 根据单链条带位置的改变判断某个个体是否存在特异的突变 依SSCP为线索还可通过扩增片段的直接测序确定突变位点 但不是所有的核苷酸序列改变都引起单链构象改变 因此SSCP并不能鉴别所有突变 35 二 基因诊断的优越性 1 针对疾病发生的根本原因 2 不受受检者发育阶段和组织材料的限制 3 特异性强 灵敏度高 适应性强 诊断范围广 基因诊断适于诊断所有单个基因突变和染色体畸变导致的疾病 目前主要用于基因病的产前诊断 36 五 肤纹分析 有的遗传病具有比较典型的肤纹特征 例如Down综合征 但肤纹分析只能作为辅助诊断方法 37 第三节出生前诊断 一 出生前诊断的对象1 夫妇之一是遗传病患者 或是平衡易位携带者 或生育过遗传病患儿的夫妇 2 X连锁遗传病基因携带者孕妇 3 原因不明的习惯性流产及羊水过多的孕妇 4 35岁以上的高龄孕妇 5 夫妇之一有致畸因素接触史的孕妇 6 有遗传病家族史 又系近亲结婚的孕妇 38 二 出生前诊断的方法与应用 1 非侵袭性方法 1 B超 利用超声波作产前诊断的疾病如下 39 2 X线 用于检查20周以后的胎儿骨骼先天畸形 但因X线对胎儿有一定影响 现很少使用 3 其他 母亲血清与尿液分析 少数种类的代谢性遗传病 CT 核磁共振等 诊断无脑儿 脑积水 脊柱裂等骨骼畸形 40 2 侵袭性方法 羊膜穿刺术 amniocentesis 是指在B超监视下 用消毒注射器抽取胎儿羊水的方法 取样的最佳时间在怀孕16 20周之间 41 绒毛取样法 孕早期 7 9周 在B超的监视下 用一特制的塑料或金属导管从阴道经宫口进入子宫 再沿子宫壁到达预定的取样位置吸取胎儿绒毛组