α-乙酰乳酸脱羧酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合型表达.pdf

基因组学与应用生物学 2 0 1 0 年 第2 9 卷 第5 期 第8 4 3 8 4 8 页 G e n o I I l i c s 粕dA p p l i e dB i o l o g 2 0 l O V 0 1 2 9 N o 5 8 4 3 8 4 8 研究报告 AL e t t e r 仪一乙酰乳酸脱羧酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合型表达 廖东庆1 陈发忠 岳田芳 张云光 黄日波 李晓明 l 广西南宁邦尔克生物技术有限责任公司 南宁 5 3 0 0 0 3 2 广西人学生命科学与技术学院 南宁 5 3 0 0 0 5 3 广西科学院 南宁 5 3 0 0 0 3 通讯作者 1 n l i O l 2 4 鲫a i l c o m 摘要仅一乙酰乳酸脱羧酶在啤酒牛产中能加快啤酒成熟 有重要的应用价值 本研究将枯草芽孢杆菌启 动子P 4 3 克隆到质粒p U C l 9 一A L D c 中的仅一乙酰乳酸脱羧酶摹因之前 得到重组质粒p U C l 9 一P 4 3 一A L D C 重组质粒p u C l9 一P 4 3 一A L D C 与质粒p M L K 8 3 一B N 同源霞组 筛选得到枯草芽孢杆菌整合质粒p M L K 8 3 一A L D C 用此整合质粒转化枯草芽孢杆菌l A 7 5 1 挑选出新霉索抗性且无淀粉酶活性的重组菌株 此菌株用L B 培养基在3 7 2 2 0r m i n 摇瓶培养过夜 测得仅一乙酰乳酸脱羧酶活力为1 5 6U m L 说明整合的仅一乙酰 乳酸脱羧酶基冈能够在重组菌株中稳定传代和表达 本研究首次在枯草芽孢杆菌中用整合型的方式重组表 达了仅一乙酰乳酸脱羧酶 提出了一种有潜力的生产旷乙酰乳酸脱羧酶的新方法 关键词仪一乙酰乳酸脱羧酶 枯草芽孢杆菌 整合表达 同源霞组 I n t e 伊a t i V eE x p r e s s i o no f 仅一a c e t o l a c t a t eD e c a r b o x y l a s eG e n ei n 日 垅瑚 T T s 配6 z Z 如 L i a oD 0 n g q i n g 1 2 C h e nF a z h o n g 1 Y u eT j a n 白n g 1 Z h a n gY u n g u a n g 1 H u a n g 尉b o 筇 X i a o m i n g 1 1G m a n 黔iN 蛐i n gB i o c l 彻eB i o t e c l l n o l o 甜C 0 圳 N 锄i n g 5 3 0 0 0 3 2C o l l e g eo fL i f eS c i e 眦e 锄dT e c h n o l o g y G 啪弘iU n i v e 倦i N a n n i n g 5 3 0 0 0 5 3G 啪黔iA c a d 锄y0 f S c i e n c e s N 缸n i n g 5 3 0 0 0 3 C 0 r r e s p o n d 她a u t h x m l i o l 2 4 舯a i l c 蛐 D O I l O 3 9 6 9 g a b 0 2 9 0 0 0 8 4 3 A b s t r a c t 仅一a c e t o l a c t a t ed e c a r b o x y l a s ep l a y sa ni m p o n a n t 印p l i e dr o l ei ns p e e d i n gu pt h em a t u m t i o no fb e e ri I l b e e rp r o d u c t i o n I I lt h i ss t u d yw eo b t a i n e dt h er e c o m b i n a mp l a s m i dp U C19 一P 4 3 一A L D Cb yc l o n i n gp r o m o t e rP 4 3 o f 召位垅獬s 配6 脚话i nt h e 劬mo f 仅一a c e t o l a c t a t ed e c a r b o x y l a s eg e n ei np l a S m i dp U C l 9 一A L D C w h i c h a sh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t e dw i t hp l a s m i dp M l L K 8 3 一B Na n do b t a i n i n gt h ei n t e g r a t i o np l a s m i dp M L K 8 3 一A L D CO f 觑饥瑚s M 6 础括 T 1 1 e nw et r a n s f o 肌e dt h ei n t e g r a t i o np l a s m i dn oB 0 c 删榔s M 娩 l A 7 5 1 a n ds e l e c t e dt h er e c o m b i n 觚ts 打a i nb yn e o m y c i l lr e s i s t a n c es c r e e n i n ga n da m y l a s ea c t i V 毋n e g a t i V es c r e e n i n g A R e ro V 锄i g l l tf l a s k i n ga t3 7 2 2 0r m i ni nL Bm e d i u m t h e 仅一a c e t o l a c t a t ed e c a r b o x y l a s ea c t i v i t i e sw a sl5 6U m Lw i t ht h i ss t r a i n T h ei n t e g r a t e d 仅一a c e t o l a c t a t ed e c a r b o x y l a s eg e n ew o u l db ep a s s a g e da n de x p r e s s e ds t a b l yi 1 1t h er e c o m b i n 觚t s t r a i n I nt h i ss t u d y w ee 叩r e s s e dr e c o m b i n a I I t 仅一a c e t o l a c t a t ed e c a r b o x y l a s eg e n ei n t e 孕a t e d l yi nB c 垅邯s 曲磁括 f o r t h ef i r s tt i m e a n dp r o p o s e dap o t e n t i a l l yn e ww a yo f p m d u c i n g 仅一a c e t o l a c t a t ed e c a r b o x y l a s e K e y w o r d sQ a c e t o l a c t a t ed e c a r b o x y l a s e 曰0 c 班潞5 6 扰蠡 l I l t e g r a t i v ee x p r e s s i o n H o m o l o g o u sr e c o m b i I l a t i o n 双乙酰 d i a c e t y l 是啤酒发酵中的风味物质 但是 啤酒中双乙酰含量超过O 1 5m g L 时就能产生令人 不愉快的馊饭味 严雨影响啤酒的风味 困家标准 G B 4 9 2 7 2 0 0 8 规定优级啤酒中双乙酰含量4 i 得高 于0 1 0m 班 仅一乙酰乳酸脱羧酶 仅一a c e t o l a c t a t e d e c a r b o x y l a s e 简称A L D C E C4 1 1 5 是一类叮有效 地降低啤酒中双乙酰含量 改善啤酒风味的酶类 它 可以直接将啤酒发酵过程中产生的双乙酰的前驱物 删 g e n o a p p l b i 0 1 o F g d o 1O 3 9 6 9 g a b 0 2 9 o 0 0 8 4 3 基金项目 本研究由广西科学研究与技术开发计划项目 桂科产1 0 1 0 0 0 2 卜2 资助 万方数据 基因组学与应用生物学 8 4 4 G e n m i c s 柚dA p p l i e dB i l o g yU e n O m l c sa n dA D D J l e d 廿1 0 1 0 9 y w w w g e n o 印p l b i 0 1 o 唱 D O I 10 3 9 6 9 g a b 0 2 9 0 0 0 8 4 3 仅一乙酰乳酸缸一a c e t o l a c 诅t e 转化为乙偶姻 a c e t o i n 使其不经过形成不良风味物质双乙酰阶段 加快啤 酒成熟 G o d t 舶d s e na n dO 竹e s e n 1 9 8 2 缩短生产周 期 提高设备利用率 具有很好的经济和社会效益 采用大肠杆菌表达系统生产A L D C 已见报道 蒙健宗等 2 0 0 1 但大肠杆菌会产生内毒素 细胞毒 素和肠毒素等对人体有害的物质 存在食品安全问 题 而且 为了保持质粒的稳定性 在生产过程中一 般需要使用抗生素 为了避免霞组微生物发酵过程 中残留的抗生素类物质对食品安全的影响 国际上 对微牛物来源的酶制剂的抗菌活性有严格限制 联 合国粮农组织和世界卫生组织下的食品添加剂联 合专家委员会 J o i n tF A O 侧H OE x p e r tC o 姗m i t t e eo n F o o dA d d i t i v e s J E C F A 和美国官方分析化学师协会 A s s o c i a t i o no fA n a l y t i c a lC o m m u n i t i e s A O A C 等图 际组织将抗菌活性列为食品用酶制剂的重要检验要 求 这对酶制剂生产企业提出了更高的要求 枯草芽孢杆菌 B s 6 t i 凰 有长期制各发酵食品 的历史 是非致病的 不产内毒素和致热敏蛋白质 是一种食品安全的菌种 被归为食品级微牛物范畴 B o e ra n dD i d e r i c h s e n 1 9 9 1 近年来对枯草芽孢杆 菌表达系统的研究发展迅速 迄今为止 已经在枯草 芽孢杆菌及其近缘种中克隆和表达了大量的原核和 真核基因 其中有的已应用于工业化生产 T e 印e 2 0 0 6 D i d e r i c h s e n 等 1 9 9 0 将来源于短芽孢杆菌 B 伽珊瑚6 r e 蠡 的A L D C 基因插入到质粒上并转化 到枯草芽孢杆菌1 6 8 衍生菌株中 成功获得表达 但 质粒在复制过程中容易形成单链D N A 中间体 G 1 1 l s s a n dE l l r l i c h 1 9 8 9 在宿主茵中通常小稳定 利用整 合质粒 将外源基因整合到枯草芽孢杆菌染色体基 因组 外源基因可以在宿主菌中稳定地遗传和表达 而且产品无抗菌活性 本研究以枯草芽孢杆菌l A 7 5 l 为研究材料 构 建含P 4 3 启动子和A L D C 基凶的整合载体p M K 8 3 一 A L D C 利用该载体将A 三D C 表达元件整合进枯草芽 孢杆菌基冈组染色体中 探索使用枯草芽孢杆菌做 为表达系统以整合方式表达外源基因 1 结果与分析 1 1p 4 3 启动子的扩增 以枯草芽孢杆菌l A 7 5 l 基因组总D N A 为模 板 P C R 扩增P 4 3 启动子 产物经1 琼脂糖凝胶电 泳分析 结果显示在约5 0 0b p 处有一特异性扩增条带 图1 与预期的片段大小相符 表明P C R 扩增成功 1 2p U C l 9 一P 4 3 一A L D C 重组质粒的鉴定 纯化枯草芽孢杆菌P 4 3 启动子P C R 产物 并将 其和质粒p U C l 9 一A L D C 分别用 i n d 和曰o m HI 双酶切后 连接得到霞组质粒p u C l 9 一P 4 3 一A L D C 将该质粒转化Ec o 如D H 5 仪感受态细胞中 挑尊菌 落扩大培养并提取质粒 所得的质粒用限制性内切 酶舟 酶切鉴定 产物经1 琼脂糖凝胶电泳分 析 结果显示得到3 条带 图2 分别约为0 5 k b 1 0 k b 和2 5k b 与理论大小一致 表明克隆成功 1 3p M L K 8 3 一A L D C 重组质粒的筛选鉴定 将线性质粒p M L K 8 3 一B N 与含P 4 3 一A L D C 的 D N A 片段按摩尔比l l 混匀 直接转化大肠杆菌感 受态细胞D H 5 仪 含P 4 3 一A L D C 基因的D N A 片段与 线性质粒p M L K 8 3 一B N 同源重组 形成闭合环状可 复制质粒 设计引物 其中上游引物在质粒p M K 8 3 一B N 上f 序列为5 C G C C A T G A C T T C A C T A A C G A 一 3 下游引物使用在P 4 3 一A L D C 上的P 4 3 一R 用菌落 P C R 鉴定筛选 阴性质粒扩增不出D N A 片段 阳性 图1P C R 产物琼脂糖凝胶电泳 注 M D N AM a r k e r 1 P 4 3 启动子P c R 产物 F i g u r elA g a r o s eg e le l e c 廿D p h o r e s i so f P C Rp I o d u c t N o t e M D N AM 砌 e r l P C Rp m d u c t o f p m m o t e rP 4 3 图2 重组质粒p U C l 9 一P 4 3 一A L D C 的舟H 的酶切验证 注 M D N A M a r k e r l 舟 酶切重组质粒 F i g u r e2V 耐f i c 嘶o no fr e c o n l b i n a n tp l a s I I l i dp U C l 9 一P 4 3 一 A L D C 谢t h n d i 辨s t i o n N o t c M D N AM a d e r l T h er e c o m b i n a mp l 砌i dd i g e s b e d b y n u 万方数据 a 一乙酰乳酸脱羧酶基因在枯草芽孢卡F 荫中的整合型表达 8 4 5 1 望塑逝堑堡曼墨巳堡 i Q 望Q 垒二垫 鲤 垒 垒堡垒 垒尘Q 墨艺 箜 g 堕也鱼签丝坐 迪f 丝 质粒扩增片段约2 0k b 从而筛选得到重组质粒到重组菌株l A 7 5 1 呷O 作为对照 分别将l A 7 5 l p M L K 8 3 一A L D C 图3 1 4 枯草芽孢杆菌l A 7 5 l A L D C 的鉴定 将所得到的整合质粒p M L K 8 3 一A L D C 转化枯 草芽孢杆菌l A 7 5 l 感受态细胞 涂布在含2 0m g m L 新霉素的L B 筛选平板上 于3 7 培养 长出的单菌 落平行点板到含l w 淀粉的两个L B 平板上 3 7 培养过夜后 取其中一平板用革兰氏碘液显色 外源基冈成功双交换到枯草芽孢杆菌染色体上的菌 落岗周没有水解圈 没有水解圈的菌落即为a 一乙酰 乳酸脱羧酶基因成功同源双交换到枯草芽孢杆菌染 色体基因组仅一淀粉酶基因位点的a 一淀粉酶缺失菌 株l A 7 5 1 A L D C 图4 1 5 枯草芽孢杆菌l A 7 5 1 A L D C 表达产物的S D S P A G E 分析 将未连有外源基因的整合质粒p M L K 8 3 一B N 同 源双交换整合到枯草芽孢杆菌1 A 7 5 1 染色体中 得 图3 重组质粮口M L K 8 3 一A L D C 的P C R 筛选验证 注 M D N AM a r k e r 卜1 5 1 7 一1 8 阴性P C R 产物 1 6 阳性 P C R 产物 F i g u r c3V e r i 丘c a t i o no fI c c o I n b i I l a n tp l a s m i dp h 似8 3 一A L D C b y P C R N o t e M D N AM a r k e r 卜1 5 1 7 一1 8 T h en e g a 石v eP C R p r o d u c t s 1 6 T h ep o s i t i v eP C Rp r o d u c t 图4 革兰氏碘液染色法筛选d 一淀粉酶缺失菌株 注 菌落A B 无透明豳 菌落C D 有透明圈 F i g u r e4I d c n t j 五c a t i o f 仪一锄y l 髂en e g a t i V ec o I o n y 喇m 娩硼 s i o d i I l es t a i n N 0 t e 1 1 1 ec l o n i e sA 锄dBw i m o u tc l e a rh a l o sa r o u I l dt h ec 0 1 0 n y T h ec I o n i e sC 锄dDw i t l lc l e 盯h a l o s 札D C l 和1 A 7 51 N E o 接种于L B 培养基 2 2 0r m i n 3 7 培养过夜 将培养物离心 取上清进行S D S P A G E 电泳分析 结果显示 1 A 7 5 l A L D C 菌株的上 清在约3 2l 处出现明显的蛋白质特征带 图5 蛋 白质分子量大小与推测一致 表明A D C 基因在P 4 3 启动子启动下得到了表达 1 6 酶活力测定 将霞组的枯草芽孢杆菌1 A 7 5 1 N E O 和1 A 7 5 l A L D C 的过夜培养物离心取上清稀释后测酶活 结 果表明 重组枯草芽孢杆菌l A 7 5 1 A L D C 能分泌表 达d 一乙酰乳酸脱羧酶 其中培养1 5h 酶活达到最 大值1 5 6U m L 表1 1 7 枯草芽孢杆菌1 A 7 5 1 A L D C 稳定性的检测 从含有2 0 斗咖L 新霉素的L B 平板上挑取 l A 7 5 1 A L D C 单菌落 接种到3I I 儿L B 培养基中 表1 重组菌在不同培养时间的表达酶活 T a b l elE x p r e s s e de n 巧m ea c t i V i 够o fr e c o m b i n a n ts 订a i n sa td 诈 f 毛r e n tc l l l t I l r e m e s 菌株 S 仃a i n 酶活 U m L E n 码 m ea c t i V 时 u m L 5 h 1 0h1 5h2 0h 重组菌1 A 7 5 l A L D C 1 2 7 11 5 6l O 3 R e c o m b i n 蛐ts 慨i n1 A 7 51 A L D C 蕈组菌l A 7 5 1 N E o O0O0 R e c o m b i n a n ts n a i nl A 7 5l 小 E 0 图5 表达产物的S D S P A G E 电泳分析 注 M 蛋白M a r k e r l 对照重组菌株1 A 7 5 l N E O 的总蛋白 2 A L D C 重组菌株l A 7 5 l A L D C 的总蛋白 F i g u r c5A n a l y s i so fe x p r e s s i o np r o d u c t sw i t hS D S P A G Ee l e c 廿叩h e r e s i s N 0 t c M P r o t e i I lM a r k e r l T o t a lp r o t e i no fc o n 仃I 胡r e c o m b i n 柚ts n 面nlA 7 51 N E 0 2 T o t a lp r o t e i no f A L D Cr c c o m b i I l a n t s 订a i n1 A 7 5l A L D C 万方数据 基因甜l 学与应用牛物学 8 4 6 G e n o m i c sa n d A p p l i e d B i o l o g y U e n O m l C Sa n dA D p l l e dB l o J 0 9 v l v w g e n o a p p l b i 0 1 o r g D 0 l 1 0 3 9 6 9 g a b 0 2 9 0 0 0 8 4 3 3 7 2 2 0r m i n 培养2 4h 菌液离心后取上清液测酶 活力 同时取3 0 L 菌液作为种子菌转接拿新的3m L L B 培养基中 一样条件进行传代培养及酶活力测 定 由图6 可看出在不含抗生素选择压力的条件下 经过连续1 0d 传代实验 产酶量无明显下降 图6 2 讨论 可复制质粒在枯草芽孢杆菌中可有一至多个拷 贝 因此目标基凶进入宿主的剂量增大 可提高目标 蛋白的表达量 研究表明 利用含P 4 3 启动子 s a c Y 信号肽的质粒转化枯草芽孢杆菌W B 6 0 0 是一个表 达外源基凶的好组合 W ue ta 1 1 9 9 1 然而质粒在宿 主菌中传代时常发生丢失现象 为避免这一问题 町 将外源基因表达元件整合到枯草芽孢杆菌染色体组 D N A 中 本实验运用整合质粒将d 一乙酰乳酸脱羧 酶基冈整合到枯草芽孢杆菌染色体基因组中的仅一 淀粉酶基l 大l 位点 由于仪一淀粉酶基因不是枯草芽孢 杆菌的必须基因 敲除仅一淀粉酶摹因并不影响卡占草 芽孢杆菌的生长和繁殖 另外 如果整合质粒p M L K 8 3 一A L D C 以同源单交换方式整合到枯草芽孢杆 菌染色体摹冈组 淀粉酶不失活 如以同源双交换方 式整合 淀粉酶失活 利用这一性质可以将同源双交 换的重组菌挑选出来 筛选方法简单有效 通过币组 双交换扶得的重组菌株 在不含抗生素选择压力的 条件F 经过连续1 0d 传代实验 产酶量无明显下 降 表明整合的仅 乙酰乳酸脱羧酶基凶可以在枯草 芽孢杆菌中稳定的传代和表达 本实验用同源霞组的方法将在p U C l 9 上的 A L D C 基冈克隆到p M L K 8 3 一B N 上 重组克降方法虽 然简单高效 却一直未能广泛使用 此技术是利用大 肠杆菌自身的 J 源重组机制 让两段D N A 在菌体内 发生雨组 这两段D N A 一般一段是线性化的载体 另一段是两侧含有分别与线性化载体两端同源序列 一 g o h 一 兰 皇吾 墓蕃 避墨 图6 连续传代培养后A L D C 重组菌株的酶活表达稳定性 F i g u r e6E x p l l e s s i o ns t a b i l 时o fA L D Cr e I 0 玎曲i n a n ts 廿a i na f t c r 辩r i a lp 鹊龆g e 的D N A 片断 发生晕组后 线性化的载体将形成一 个闭环的载体 从而能够在大肠杆菌中复制 B u b e c k e ta 1 1 9 9 3 由于从p U C l 9 一P 4 3 一A L D C 双酶切得到 的P 4 3 一A L D CD N A 片段与质粒p M L K 8 3 一 B N 有两段同源臂 因此可以利用同源重组整合到质 粒p M L K 8 3 一B N 上 同源重组的克隆方法与常用的 连接克隆方法相比简单高效 本试验说明质粒p M K 8 3 一B N 能够有效地作为克隆外源基冈到枯草芽孢杆 菌中进行整合表达的一种载体的选择 整合在枯草芽孢杆菌中的外源基冈的表达量与 几个冈素密切相关 首先 启动子不同 外源基因的 表达量不同 P 4 3 启动子是来源于枯草芽孢杆菌的一 个强的启动子 V n ga n dD o i 1 9 8 4 在枯草芽孢杆 菌中 以G 胛为报告基冈 与启动子P t n l s P a m y 相 比 枯草芽孢杆菌P 4 3 启动子表达量最大 G a te ta 1 2 0 0 3 其次 信号肽不同 外源基冈表达的量也不同 以枯草芽孢杆菌D B 4 0 3 B 班ns 6 i 凰D B 4 0 3 为宿 主菌 用枯草芽孢杆菌的s n c B 基冈启动子来表达 B 0 c i 盯 矗e 枷舀肌如的仪一淀粉酶基冈 来源丁枯尊 芽孢杆菌s o c 启基囚的信号肽的表达量比来源于 B 伽洲 如 e 凡i 疡r n 蠡的d 一淀粉酶基冈自身的信号肽 的表达量大 H e n ge ta 1 2 0 0 5 再次 整合基因的表达 水平与其所在的染色体位置有关 w o r k i n 粕dL o s i c k 2 0 0 1 本实验将枯草芽孢杆菌P 4 3 启动子连同 A D C 基因以同源双交换的方式整合到枯草芽孢杆 菌1 A 7 5 1 染色体帆佃基因位点中 使表达元件能 够稳定遗传并获得表达 然而 在其它基因整合位点 可能会得到更高的表达量 目前已经开发了一些新的 基凶整合位点 如k 4 位点 H 苴r t le ta 1 2 0 0 1 p D g 驰和s n c 4 位点 M i d d I e t o na n dH o f h l e i s t e r 2 0 0 4 最 后 外源基因的表达量与其在染色体中的拷贝数有 关 石爱琴等 2 0 0 9 成功将外源基因戌M 分别整合 进枯草芽孢杆菌染色体基凶组 l l o I a p r E 和v p r 三 个不同的基冈座位 发现整合的拷贝数越多 P G A 的 表达量越高 本试验得到的仅一乙酰乳酸脱羧酶的表 达量不够高 为进一步提高表达酶活 达到工 I k 化生 产的要求 我们将进一步进行以下研究 1 尝试不同 启动子 信号肽等调控元件 2 尝试在染色体的不同 位点进行整合 3 增加整合的基因剂量 3 材料和方法 3 1 菌株与质粒 本研究中使用到的菌株和质粒详细信息见表2 万方数据 q 一乙酰乳酸脱羧酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合型表达 8 4 7 坐丝g 垡丛i 兰巳堕 i Q 望旦 垡二璺 宝 Q 垒里 坚垒曼 垒 垒Q 型 璺 g 塾 也些 竺i 垒坚 地 鲤鱼 表2 本研究使用的菌株和质粒 T a b l e2S 昀i n sa n dp l a s m i d su di I lm i ss t u d y 菌株与质粒来源 S t f a l n sa n dp I a s m i d s 大肠杆菌D H 5 q Ec o 矗D H 5 a 枯草芽孢杆菌1 A 7 5 l 觑i f f 瓣s 曲砌bl A 7 5 1 枯草芽孢杆菌lA 7 51 A L D c B 缸删w5 M 6 础厶1 A 7 5l A L D C 质粒p M L K 8 3 一B N P l a s m i dp M L K 8 3 一B N 质粒p U C l 9 一A L D C P l a s m i dp U Cl9 一A L D C 质粒p U C l 9 一P 4 3 一A L D C P l a s m i dD U C l 9 一P 4 3 一A L D C 质粒p M L K 8 3 一A L D C P l a s m i dD M L K 8 3 一A L D C S O u r c e s 天根牛化公司 T i a n g e n 美国芽孢杆菌遗传保藏中心 T h eB c i f f wG 即e t i cS t o c k 本研究 T h i ss t u d y 邦尔克生物 B i o c l o n e 邦尔克生物 B i o c l o n e 本研究 1 1 1 i ss t I l d v 本研究 T h i ss t u d y 3 2 试剂和培养基 P r i m eS T A RH SD N A 聚合酶 限制性核酸内切 酶和T 4D N A 连接酶购自T a K a R a 公司 细菌基冈组 D N A 提取试剂盒 质粒提取试剂盒 琼脂糖凝胶 D N A 回收试剂盒 D N A 产物纯化试齐 J 盒 D N A M a r k e r 和蛋白质M a r k e r 购白天根生化科技 北京 有 限公司 Y e a s te x 仃a c t 和T r y p t o n e 购自O X O I D 公司 其余试剂均为国产分析纯 L B 培养基组分为 1 w T 聊 t o n e 0 5 w v Y e a s te x t r a c t 和l w v N a C l 固体L B 培养基添加1 5 w v 琼脂粉 3 3 枯草芽孢杆菌总D N A 的提取 枯草芽孢杆菌l A 7 5 1 基因组D N A 的提取方法 详见细菌基冈组D N A 提取试剂盒说明书 3 4 质粒p U C l 9 一P 4 3 一A L D C 的构建 大肠杆菌质粒的提取纯化 酶切 连接及转化参 照S a m b r o o k 和R u s s e l l 2 0 0 1 进行 根据G e n b a n k 中 注释的枯草芽孢杆菌P 4 3 启动子序列 设计上游引 物P 4 3 一L 5 L A T T G C T G G A C G C T T A T G G A C 一3 和下 游引物P 4 3 一R 5 L C G G G A T C C A T T C C T C T C T T A C C T A T A A T 一3 P c R 反应体系为1 0 0 斗L 枯草芽孢杆菌1 A 7 5 l 基因组D N A 模板l 斗L 约2 0 n 曲 5 P r i m e S T A R B u 仁 f b r2 0 肛L 1 0p m o l Ld N T P2 斗L 1 0p m o l L 正反 向引物各2 灿L 2 5U LP r i m e S T A RH SD N A 聚合 酶l 斗L 添加d d H 2 0 至总体积1 0 0 L P C R 反应程 序 9 4 5m i n 9 4 3 0s 6 0 3 0 s 7 2 4 0s 3 0 个循 环 7 2 1 0m i n 4 保存 P C R 产物用1 琼脂糖凝 胶电泳检测 经琼脂糖凝胶电泳纯化后的P C R 产物和质粒 p U C l 9 一A L D C 分别用 i n d 和B 册l HI 进行双酶 切 酶切产物经D N A 产物纯化试剂盒纯化后用T 4 连接酶进行连接 转化到Ec o 尻D H 5 仅感受态细胞 中 经限制性内切酶而 酶切筛选鉴定获得币组 质粒p U c l 9 一P 4 3 一A L D c 委托北京三博远志生物公 司进行测序 3 5 质粒p M L K 8 3 一A L D C 的构建 质粒p U C l 9 一P 4 3 一A L D C 用 协I 慨o XI 双酶 切 琼脂糖凝胶电泳回收含P 4 3 一A L D C 基冈的片段 质粒p M L K 8 3 一B N 用启凹l HI 酶切 线性p M L K 8 3 一 B N 与含P 4 3 一A L D C 的D N A 片段按摩尔比l 1 混 匀 直接转化大肠杆菌感受态细胞D H 5 仅 经菌落 P c R 筛选得到目的质粒p M L K 8 3 一A L D C 3 6 重组枯草芽孢杆菌的构建 枯草芽孢杆菌1 A 7 5 1 感受态细胞的制备及转化 方法参阅网站h 却 w n b g s c o r C a t p a 以 p d f o 将整 合质粒p M L K 8 3 一A L D C 或p M L K 8 3 一B N 与枯草芽 孢杆菌1 A 7 5 l 感受态细胞混匀 3 7 2 5 0r m i n 培 养9 0m i n 取菌液涂布含新霉素2 0 咖L 的筛选平 板上 长出的单菌落平行点板到含1 w v 淀粉的 两个L B 平板上 3 7 培养过夜后 取其中一平板用 革兰氏碘液显色 通过淀粉酶平板透明圈法筛选得 到外源基因以双交换方式整合到染色体基凶组上的 菌株 1 白r o wa I l dP i g g o t 1 9 9 5 3 7 目的蛋白的表达及分析 分别挑取重组枯草芽孢杆菌1A 7 5l A L D C 或l A 7 5 l 时E O 的单菌落到L B 液体培养基中 3 7 条件 下 2 2 0r m i n 过夜培养 离心 上清液进行1 5 S D S P A G E 电泳检测 S D S P A G E 电泳检测参照M a n i a t i s 等 1 9 8 9 方法进行 3 8 酶活测定 仅一乙酰乳酸脱羧酶酶活的测定方法参照中华 人民共和国国家标准 G B 2 0 7 1 3 2 0 0 6 进行 简单描 述如下 仅一乙酰乳酸脱羧酶与底物仅一乙酰乳酸反 应脱羧生成乙偶姻 乙偶姻在碱性条件下与荼酚和 肌酸的混合物反应生成红色产物 通过在5 2 2n m 下 测定溶液的吸光度 可以从乙偶姻标准曲线上得出 万方数据 基因组学与应用牛物学 8 4 8 G e n m i c sa n d A p p e d B i o l o g y L j e n O m l C Sa n dA D D I l e dB 1 0 1 0 9 V w w w g e n o 印p l b i 0 1 o r g D O I lO 3 9 6 9 g a b 0 2 9 0 0 0 8 4 3 反应生成的乙偶姻量 进而计算出d 一乙酰乳酸脱羧 酶的酶活力 酶活定义为 在3 0 p H6 0 的条件下 lg 或1m L 酶样品与底物仅一乙酰乳酸起反应 每分 钟生成1 岬o l 的3 一羟基一2 一丁酮 乙偶姻 即为 1 个酶活力单位 以U g 或U m L 表示 3 9 枯草芽孢杆菌1 A 7 5 1 A L D C 产酶稳定性的测定 从含2 0 m L 新霉素的L B 平板上将枯草芽孢 杆菌1 A 7 5 1 A L D C 单菌落接到3m LL B 培养基中 3 7 2 2 0r m i I l 培养2 4h 取3 0 L 菌液作为种子转 接至新的3n 也L B 培养基中 同时剩余的菌液离心 取上清测酶活力 连续1 0d 用同样条件进行传代及 酶活测定 参考文献 B u b e c kP W i n k l e rM a l l dB a u t s c hW 19 9 3 R 印i dc l o n 试gb y h 咖o l o g o u sr e c o m b i n a o n 讥口如D N u c l e i cA c i d sR e s e a r c h 2 l 1 5 3 6 0 1 3 6 0 2 d e B o e r A S a r I d D i d e c h s e nB 1 9 9 1 o n m e 鼢f b t y o f 广西大学生命 科学与技术学院 南宁 530005 陈发忠 岳田芳 张云光 李晓明 Chen Fazhong Yue Tianfang Zhang Yunguang Li Xiaoming 广西南宁邦尔克生物技术有限责任公司 南宁 530003 黄日波 Huang Ribo 广西大学生命科学与技术学院 南宁 530005 广西科学院 南宁 530003 刊名 基因组学与应用生物学 英文刊名 GENOMICS AND APPLIED BIOLOGY 年 卷 期 2010 29 5 参考文献 18条 参考文献 18条 1 Sambrook J Russell D W Molecular cloning a laboratory manual 2001 2 Terpe K Overview of bacterial expression systems for heteroiogous protein production from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems 外文期刊 2006 02 3 石爱琴 胡海红 胡艳华 李敏 丁明 赵辅昆 青霉素酰化酶 PGA 在枯草芽孢杆菌基因组上的整合表达 期刊论文 浙江理工大学学报 2009 05 4 Heng C Chen Z Du L Lu F Expression and secretion of an acid stable amylase gene in Bacillus subtilis by SacB promoter and signal peptide 外文期刊 2005 21 5 Hartl B Wehrl W Wiegert T Homuth G and Schumann W Development of a new integration site within the Bacillus subtilis