感受态细胞的制备方法.doc

_感受态细胞的制备方法1、 感受态定义、作用、常用制备方法及原理2、 感受态细胞不好用的原因3、 影响转化效率的原因4、 为何要低温环境制备1.感受态定义：细胞能够从周围环境中摄取DNA分子，并且不易被细胞内的限制性核酸内切酶分解时所处的一种特殊生理状态称感受态（competence）。作用：如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。感受态的目的是增加细胞的通透性，以便外源基因进入宿主细胞，实现转化的目的。优点是细胞膜通透性增大，方便大分子的进入。意义是实验转移外源DNA分子进入受体细胞，完成实验。常用制备方法：细菌感受态少量制备法（CaCl2法）、细菌感受态大量制备法、细菌电转化法等 详见基因工程实验指导p153-157.2.感受态细胞做得不好的原因一菌液OD值 偏大或偏小二原始菌株不好三试剂超纯程度不够四操作时对菌体伤害过大3. 影响转化效率的原因1细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度,尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制.DH5菌株 OD600为 0.5 时细胞密度是 5 107/ml ）；2所有操作均应在无菌条件和冰上进行；3经 CaCl2处理的细胞,在低温条件下,一定的时间内转化率随时间的推移而增加, 24小时达到最高,之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；4化合物及无机离子的影响：在 Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如 Mn2+或 Co2+）、 DMSO 或还原剂等物质处理细菌,可使转化效率大大提高（ 100-1000 倍）；5所使用的器皿必须干净.迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；6质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的 DNA ；7一定范围内,转化效率与外源 DNA 的浓度呈正比；4为何要低温环境制备在制备过程中,细胞膜通透性增大而变得脆弱,低温能提高感受态细胞存活率.所以在制备感受态细胞时要保持低温和不能剧烈震荡.如果放于-20保存，时间长了细胞内部液化度较高的情况下，细胞会由于流动性的原因造成不可逆损伤，甚至死亡。所以要放于-80摄氏度。原理：利用化学法CaCl2处理对数生长期的DH5大肠杆菌或TG1大肠杆菌（-为何选择这两种菌、两种菌的不同处、生长曲线的不同处），使其对外源DNA通透性增加，从而达到外源DNA分子进入细菌的目的。BL21一般用于外源基因的原核表达，DH5a，TG1和HB2151一般用于重组质粒的克隆和扩增。TG1长得慢，菌落较小，转化效率高，用于普通的克隆测序，BL21(DE3)长的快，菌落较大，转化效率低点，主要用于原核表达。DH5是扩增菌，BL21是表达菌DH5可以使质粒高拷贝数扩增，BL21利于蛋白的表达，另外表达菌还有很多，ps系列，roset系列等DH5大肠杆菌：此种大肠杆菌，是一种诱变菌株，主要表现对外源DNA的免疫缺乏。是用于基因工程的菌种，相比于正常菌种缺少了一定的免疫机制。试剂：（1） DH5 E.coli菌株E.coli K-12衍生菌（2） 80mM（mmol/L） CaCl2（灭菌） （0.44g50mL，摇匀；0.88g CaCl2100mL H2O）（3） 液体LB培养基（实验室直接购买现成的，不需要配制）（-浓度是如何确定的 这个查查看 我没查过 看看浓度是否有影响）取250mL三角瓶2，洗净2.5g100mLddH2O并摇匀使其溶解后，按1:1000比例加入100L 1mol/L（1M）NaOH调节至PH7.0（4） 甘油（100%甘油，10mL或20mL） 15mL/管2高温灭菌 121，20min对于E.coli菌株用8种不同浓度的CaCl2制备感受态细胞,然后转化各浓度的感受态细胞。实验结果表明,不同浓度CaCl2溶液处理所得到的感受态细胞,其转化效率有很大的不同。随着CaCl2浓度增高,转化效率也随之提高,在80mmol/L100mmol/L时达到峰值,进一步提高CaCl2的浓度,转化效率急剧下降。（CaCl2浓度对感受态细胞转化效率的影响 王友如 (湖北师范学院生物系,湖北黄石 435002)）灭菌的准备及试剂配置（1） CaCl2，100mL分装于2个50mL管中，灭菌备用。（2） 甘油，10mL备用灭菌（3） 1个Amp LB固体培养基平板（用于划线，挑去单克隆菌株）（4） 100mL Amp 培养基（5） 1020个 10mL离心管48个 50mL离心管感受态细胞的制备（化学CaCl2法）-实验操作中严格灭菌、低温、速度 DH5菌株在Amp LB固体培养基平板上划线，37培养1216h，至其长出单克隆菌株。（-划线作用、培养时间作用）TG1菌株生长速度比DH5快，只需37培养812h划线作用用接种环在平板培养基表面通过分区划线而达到纯化分离微生物的一种方法。是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离的目的。用于目的微生物的分离，便于得到目的性状的单克隆。培养时间从图1可以看出,重组大肠杆菌DH5生长的4 个时期区分非常明显。03h为迟缓期,重组大肠杆菌适应新的环境,繁殖的速度很慢;49h为对数生长期,此时营养物质很充分,重组大肠杆菌呈对数快速增长;1016h为稳定期,由于培养基中的营养物质不断地被消耗掉,重组大肠杆菌新陈代谢产生的毒性物质的积累以及pH值下降等因素的影响,重组大肠杆菌繁殖的速度逐渐下降,而死亡的细菌数开始逐渐增加,增殖数与死亡数渐趋平衡,细菌总数处于稳定的状态;1720h为衰亡期,由于营养物质逐渐减少,而毒性物质越来越多,重组大肠杆菌的繁殖速度就逐渐减缓,死亡菌数明显增多,衰亡的速度超过繁殖的速度,细菌总数就呈现下降趋势。所以选择培养时间为1216小时。 Amp LB平板上挑取单菌落，轻移至1mL LB Amp 液体培养基中（2mL离心管），37 220rpm/min，摇床37培养8h左右。 取1mL2的空白培养基做对照暂存于4度，将1mL 活化菌液全部转移至100mL LB Amp 液体培养基中，37，220rpm/min培养2h3h，使其OD600约等于0.40.6（处于对数生长期）（-培养时间可否延长，OD值为何测OD600，其数值可否超过0.6，原因什么） 注：测OD值准备-枪、枪头、菌液、空白培养基、ddH2O、纸巾空白对照：第三步去除的空白培养基 实验组：摇菌后的菌进行第四步之前准备冰、冰盒、10ml管、菌液全部埋于冰中。2ml或1.5ml空管放-20预冷。培养时间应该不能延长，死亡细菌数量会增多，造成细菌总量下降。OD600实验室确定细菌生长密度和生长期，多根据经验和目测推断细菌的生长密度。在遇到要求较高的实验，需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度。OD600是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。以未加菌液的培养液作为空白液，之后定量培养后的含菌培养液。测量细菌培养液在600nm处的吸光值，得到的OD600的数值如果在0.6-0.8之间，表明细菌处于旺盛生长的对数生长期，OD6003表明细菌已经饱和等。细菌的生长情况,可以通过测OD600来监测。细菌的生长比较好的时期是在OD600为1时,此时可以进行转代等研究.在细菌的培养中,OD600超过0.8就要稀释培养液。 不同的菌种的OD600的标准可能不同，对于DH5而言，OD600值为0.40.6为对数生长期。如果超过0.6的话，细菌的繁殖速度开始下降、生长力下降，一些细菌会老化死亡。 将培养液置于冰上10min，然后，将菌液分装至10mL管中，3000rpm或4000rpm 4度离心4min6min，收集细菌沉淀。 弃上清（把剩余菌液吸掉！）用预冷的80mmol/L CaCl2轻轻重悬细菌（轻轻吹打，10次左右），每20mL培养液可用2mL CaCl2重悬，然后，置于冰上冰浴4060min，30004000rpm 4度离心6min10min，弃上清，保留菌体沉淀。（-CaCl2作用） 每100mL液体培养基对应56mL CaCl2/甘油重悬 每管1mL或2mL都可CaCl2/甘油溶液为=（-为何用CaCl2/甘油溶液=1:4保菌 有什么说法） 感受态细胞置于-80或-40冰箱保存备用。用2mL离心管或1.5ml离心管(之前已提前预冷)分装好，离心管要提前置于-20预冷。注：TG1菌株（8h）比DH5菌株（16h）生长速度快近一倍。CaCl2作用：增加细胞的通透性细菌处于 0,CaCl2 的低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的 DNA 形成抗DNase 的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经 42短时间热冲击处理,促使细胞吸收 DNA 复合物.钙离子的作用是结合于细胞膜上,是细胞膜呈现一种液晶态.在冷热变化刺激下液晶态的细胞膜表面会产生裂隙,使外源DNA进入.甘油作用：保菌一、冷冻保存时菌液会被冻起来，内部产生的“冰晶”会使细胞破裂等，加入如甘油后可以 防止对细胞的伤害。二 、简单来说就是抗冻，原理是甘油