丝氨酸羟甲基转移酶的电泳制备.pptVIP

项目四丝氨酸羟甲基转移酶的电泳制备 姓名 吴彩霞班级 生药1313组别 第1组学号 2013040930指导老师 彭加平韦平和王芳 背景知识 丝氨酸羟甲基转移酶 SHMT 在自然界中普遍存在 它的生理学功能是催化丝氨酸和甘氨酸之间可逆的互换 SHMT的催化反应是氨基酸和核酸代谢的连接点 在氨基酸的工业生产和植物的光呼吸过程中 SHMT也是一个关键酶 L 丝氨酸是氨基酸输液的重要成分 化妆品的添加剂 酶法生产色氨酸的前体物质 L 丝氨酸在体内代谢速度极快 因此 直接发酵生产很困难 酶法合成L 丝氨酸由于利用甘氨酸和甲醛特异的合成L 丝氨酸 具有原料来源方便 原料成本低和可合成高浓度产品等优点 因此是最有前景的L 丝氨酸生产方法 2 3 1 电泳是指带电颗粒在电场中将受到电场力的作用而发生泳动 2 这种特性 用电泳的方法对这些物质进行定性及定量分析 也可用于混合物的分离3 凝胶电泳由于其操作简单 快速 灵敏等优点 已成为蛋白质 核酸研究的首选标准方法 4 按分离原理 区带电泳 移界电泳 等速电泳和聚焦电泳4种区带电泳 电泳过程中 不同的离子成分在均一的缓冲液中分离成独立的区带 这是当前应用最广泛的电泳技术 区带电泳分类 按支持物物理性状分类1 滤纸及其他纤维素膜电泳 2 粉末电泳 如纤维素粉 淀粉 玻璃粉电泳 3 凝胶电泳 如琼脂糖 淀粉胶 聚丙烯酰胺凝胶电泳 4 丝线电泳 如尼龙丝 人造丝电泳 按支持物的装置形式不同分类1 平板式电泳2 垂直板式电泳 3 连续流动电泳按pH的连续性不同分类1 连续pH电泳 电泳全部过程中缓冲液pH保持不变 2 不连续pH电泳 电泳技术的分类 5 凝胶电泳技术 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集 最常用的就是SDS PAGE电泳技术SDS PAGE电泳可用圆盘和垂直平板电泳的形式 原理相同 步骤也大致相同 SDS PAGE电泳亦分为不连续系统和连续系统 本实验采用垂直平板以不连续系统的SDS 聚丙烯酰胺凝胶方式进行电泳 垂直平板电泳的优点在于在一块凝胶平板上可以同时进行不同样品的电泳 因此条件一致 更加便于比较 6 二 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 polyacrylamidegelelectrophoresis 是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳这种凝胶由丙烯酰胺 acrylamide 简称Acr 和交联剂N N 甲叉基 亚甲基 双丙烯酰胺 N N methylene bis acrylamide 简称Bis 聚合而成 PAGE电泳是根据蛋白质分子 或其它生物大分子 所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率而分离成若干条区带 聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好 弹性大 透明 化学稳定性高 无电渗作用 设备简单 用样量少 1 100 g 和分辨率高等优点 并可通过控制单体浓度或单体与交联剂的比例聚合成孔径大小不同的凝胶 可用于蛋白质 核酸等物质的分离 定性和定量分析 还可结合去垢剂十二烷基硫酸钠 SDS 以测定蛋白质亚基分子量 7 三 实验原理 1 带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动 这种现象称为电泳 2 蛋白质分子是两性电解质 pH pI时该蛋白质带负电荷 反之pH pI时该蛋白质带正电荷 3 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS 十二烷基磺酸钠 SDS能断裂分子内和分子间氢键 破坏蛋白质的二级和三级结构 强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂 蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中 与SDS分子按比例结合 形成带负电荷的SDS 蛋白质复合物 这种复合物由于结合大量的SDS 使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块 从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异 由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的 因此在进行电泳时 蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小 8 三 实验原理 4 当蛋白质的分子量在15000 200000之间时 电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系 符合下列方程 1gMr K bmR式中 Mr为蛋白质的分子量 K为常数 b为斜率 mR为相对迁移率 在条件一定时 b和K均为常数 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图 可获得一条标准曲线 未知蛋白质在相同条件下进行电泳 根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量 9 5 聚丙烯酰胺的作用 丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体 其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否 与促凝剂及环境密切相关 6 TEMED与AP 促凝作用 加速聚丙烯酰胺的凝固 AP中含有29的丙烯酰胺和1的甲叉基聚丙烯酰胺 能产生自由氧基 使丙烯酰胺聚合 7 十二烷基硫酸钠 SDS 阳离子去污剂 作用有四 去蛋白质电荷 解离蛋白质之间的氢键 取消蛋白分子内的疏水作用 去多肽折叠 三 实验原理 AP是过硫酸铵 10 夹心垂直板电泳槽示意图1 样品槽模板2 长玻璃板3 凹形橡胶框4 样品槽模板5 固定螺丝6 上贮槽7 冷凝系统 11 12 四 仪器 原料和试剂 仪器 垂直板型电泳槽 天平 直流稳压电源 50或100 l微量注射器 玻璃板 水浴锅 染色槽 烧杯 吸量管 常头滴管等 原料 SHMT标准蛋白质按照每种蛋白0 5 1mg ml 1样品溶解液配制 可配制成单一蛋白质标准液 也可配成混合蛋白质标准液 试剂 1 分离胶缓冲液 Tris HCl缓冲液PH8 9 取1mol L盐酸48mL Tris36 3g 用无离子水溶解后定容至100mL 2 浓缩胶缓冲液 Tris HCl缓冲液PH6 7 取1mol L盐酸48mL Tris5 98g 用无离子水溶解后定容至100mL 3 30 分离胶贮液 配制方法与连续体系相同 称丙烯酰胺 Acr 30g及N N 甲叉双丙烯酰胺 Bis 0 8g 溶于重蒸水中 最后定容至100ml 过滤后置棕色试剂瓶中 4 保存 4 10 浓缩胶贮液 称Acr10g及Bis0 5g 溶于重蒸水中 最后定容至100mL 过滤后置棕色试剂瓶中 4 贮存 5 10 SDS溶液 SDS在低温易析出结晶 用前微热 使其完全溶解 6 1 TEMED 13 四 仪器 原料和试剂 7 10 过硫酸铵 AP 现用现配 8 电泳缓冲液 Tris 甘氨酸缓冲液PH8 3 称取Tris6 0g 甘氨酸28 8g SDS1 0g 用无离子水溶解后定容至1L 9 样品溶解液 取SDS100mg 巯基乙醇0 1mL 甘油1mL 溴酚蓝2mg 0 2mol L pH7 2磷酸缓冲液0 5mL 加重蒸水至10mL 遇液体样品浓度增加一倍配制 用来溶解标准蛋白质及待测固体 10 染色液 0 25g考马斯亮蓝G 250 加入454mL50 甲醇溶液和46mL冰乙酸即可 11 脱色液 75mL冰乙酸 875mL重蒸水与50mL甲醇混匀 14 四 仪器 原料和试剂 五 实验步骤 15 安装电泳槽凝胶制备样品处理与加样电泳剥胶与固定染色与脱色 五 实验步骤 1 安装夹心式垂直板电泳槽 安装前 胶条 玻板 槽子都要洁净干燥 装上贮槽和固定螺丝钉 仰放在桌面上 将长 短玻璃板分别插到硅橡胶框的凹形槽中 勿用手接触灌胶面的玻璃 将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上 短玻璃板应面对上贮槽 将下贮槽的销孔对准以装好螺丝钉的上贮槽 双手以对角线的方式旋紧螺丝帽 竖直电泳槽 在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1 琼脂 以封住空隙 加琼脂溶液时 应防止气泡进入 16 17 2020 3 15 18 可编辑 19 3 制备凝胶板 1 分离胶制备 按表配制20ml10 分离胶 混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长 短玻璃板间的缝隙内 约8cm高 用1ml注射器取少许蒸馏水 沿长玻璃板板壁缓慢注入 约3 4mm高 以进行水封 约30min后 凝胶与水封层间出现折射率不同的界线 则表示凝胶完全聚合 倾去水封层的蒸馏水 再用滤纸条吸去多余水分 2 浓缩胶的制备 按表配制10ml3 浓缩胶 混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方 直至距离短玻璃板上缘约0 5cm处 轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内 避免带入气泡 约30min后凝胶聚合 再放置20 30min 待凝胶凝固 小心拔去样品槽模板 用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分 将pH8 3Tris 甘氨酸缓冲液倒入上 下贮槽中 应没过短板约0 5cm以上 即可准备加样 20 4 样品处理及加样各标准蛋白及待测蛋白都用样品溶解液溶解 使浓度为0 5 1mg mL 沸水浴加热3分钟 冷却至室温备用 处理好的样品液如经长期存放 使用前应在沸水浴中加热1分钟 以消除亚稳态聚合 一般加样体积为10 15 L 即2 10 g蛋白质 如样品较稀 可增加加样体积 用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部 待所有凹形样品槽内都加了样品 即可开始电泳 21 5 电泳将直流稳压电泳仪开关打开 开始时将电流调至10mA 待样品进入分离较时 将电流调至20 30mA 当蓝色染料迁移至底部时 将电流调回到零 关闭电源 拔掉固定板 取出玻璃板 用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去 在胶板一端切除一角作为标记 将胶板移至大培养皿中染色 6 染色及脱色将染色液倒入培养皿中 染色1h左右 用蒸馏水漂洗数次 再用脱色液脱色 直到蛋白区带清晰 即用直尺分别量取各条带与凝胶顶端的距离 22 大分子 小分子 缓冲液 小分子走在前头 大分子滞后 23 24 结果分析 25 相对迁移率mR 样品迁移距离 cm 染料迁移距离 cm 计算 26 知识补充 SDS PAGE电泳过程中影响结果的因素 1 配胶缓冲液系统对电泳的影响 在SDS PAGE不连续电泳中 制胶缓冲液使用的是Tris HCL缓冲系统 浓缩胶是pH6 7 分离胶pH8 9 而电泳缓冲液使用的Tris 甘氨酸缓冲系统 在浓缩胶中 其pH环境呈弱酸性 因此甘氨酸解离很少 其在电场的作用下 泳动效率低 而CL离子却很高 两者之间形成导电性较低的区带 蛋白分子就介于二者之间泳动 由于导电性与电场强度成反比 这一区带便形成了较高的电压剃度 压着蛋白质分子聚集到一起 浓缩为一狭窄的区带 当样品进入分离胶后 由于胶中pH的增加 呈碱性 甘氨酸大量解离 泳动速率增加 直接紧随氯离子之后 同时由于分离胶孔径的缩小 在电场的作用下 蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离 所以 pH对整个反应体系的影响是至关重要的 实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况 应首要考虑该因素 27 2 样品如何处理 根据样品分离目的不同 主要有三种处理方法 还原SDS处理 非还原SDS处理 带有烷基化作用的还原SDS处理 1 还原SDS处理 在上样buffer中加入SDS和DTT 或Beta巯基乙醇 后 蛋白质构象被解离 电荷被中和 形成SDS与蛋白相结合的分子 在电泳中 只根据分子量来分离 一般电泳均按这种方式处理 样品稀释适当浓度 加入上样Buffer 离心 沸水煮5min 再离心加样 2 带有烷基化作用的还原SDS处理 碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团 得到较窄的谱带 另碘乙酸胺可捕集过量的DTT 而防止银染时的纹理现象 100ul样品缓冲液中10ul20 的碘乙酸胺 并在室温保温30min 28 3 SDS PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用 聚丙烯酰胺的作用 丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体 其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否 与促凝剂及环境密切相关 制胶缓冲液 浓缩胶选择pH6 7 分离胶选择pH8 9 选择tris HCL系统 TEMED与AP AP提供自由基 TEMED是催化剂 催化自由基引起的聚合反应进行 十二烷基硫酸钠 SDS 阳离子去污剂 作用有四 去蛋白质电荷 解离蛋白质之间的氢键 取消蛋白分子内的疏水作用 去多肽折叠 4 提高SDS PAGE电泳分辨率的途径 聚丙烯酰胺的充分聚合 可提高凝胶的分辨率 建议做法 待凝胶在室温凝固后 可在室温下放置一段时间使用 忌即配即用或4度冰箱放置 前者易导致凝固不充分 后者可导致SDS结晶 一般凝胶可在室温下保存4天 SDS可水解聚丙烯酰胺 一般常用的有氨基黑 考马斯亮蓝 银染色三种染料 不同染料又各自不同的染色方法 29 5 微笑 两边翘起中间凹下 形带原因 主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致 多出现于较厚的凝胶中 处理办法 待其充分凝固再作后续实验 6 皱眉 两边向下中间鼓起 形带原因 主要出现在蛋白质垂直电泳槽中 一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净 处理办法 可在两板间加入适量缓冲液 以排除气泡 7 为什么带出现拖尾现象 主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的 处理办法 加样前离心 选择适当的样品缓冲液 加适量样品促溶剂 电泳缓冲液时间过长 重新配制 降低凝胶浓度 8 为什么带出现纹理现象 主要是样品不溶性颗粒引起的 处理办法 加样前离心 加适量样品促溶剂 30 9 什么是 鬼带 如何处理 鬼带 就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时 常会出现在泳道顶端 有时在浓缩胶中 的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀 主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性 致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合 聚合成大分子 其分子量要比目标条带大 有时不能进入分离胶 但它却于目标条带有相同的免疫学活性 在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用 处理办法 在加热煮沸后 再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇 以补充不足的还原剂 或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化 10 为什么溴酚蓝不能起到指示作用 我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底 但蛋白质却还未跑下来的现象 主要与缓冲液和分离胶的浓度有关 处理办法 更换正确pH值的Buffer 降低分离胶的浓度 11