蛋白质相互作用多种方法.ppt

蛋白质相互作用研究方法 赵丽娜 Proteininteraction twoormoreproteins sameordifferent interactorformcomplex 人类蛋白质组相用 有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用 但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子或是与其他蛋白质一起发挥作用的 蛋白质相关知识及研究蛋白质相互作用的必要性 蛋白质相互作用 本身具有生物学意义 这样的相互作用在生物体中是起什么作用发展技术 利用这样的相互作用创造出一些人为的作用 运用生物信息学的方法由繁入简 实验分析的方法由简入繁 整体 系统 部分 单体 酵母蛋白质相互作用联络图 人蛋白质相互作用联络图 研究蛋白质相互作用的目的是发现并明确其相互作用的生物学意义蛋白质相互作用是一种表象 通过表象分析规律 是研究蛋白质相互作用的核心 种瓜得瓜 种豆得豆 是一种表象 反映了遗传这样一种本质现象可研究对象合适的研究方法 研究蛋白质相互作用需要微观和宏观的结合 象与象的一部分 研究蛋白质相互作用的意义1 蛋白质间的相互作用是细胞生命活动的基础 2 基因只是决定蛋白质 而蛋白质才是发挥作用的主体 蛋白质的相互作用是发挥其功能的主要活动 生物学效应 稳定的相互作用与瞬间的相互作用共同构成蛋白质相互作用的内涵 研究蛋白质相互作用是为了研究相应的生物学功能 确定研究目标 寻找相互作用 建立相互作用网络和功能体系 从蛋白质相互作用到生物学功能 运用蛋白质直接相互作用 发现相互作用蛋白质 再分析这些作用的生物学意义 容易犯的错误 研究一大堆的蛋白相互作用 却不知道这些相互作用有什么生物学意义 从生物学功能到蛋白质相互作用 通过改变生物学现象 分析蛋白质间的遗传相互作用 进一步研究相关蛋白质的相互作用 容易犯的错误 找到了平行变化的不相关蛋白质 免疫共沉淀 噬菌体展示技术 酵母双杂交技术 基因外抑制子 合成致死筛选 分子生物学方法 Pulldown试验 遗传学方法 蛋白质相互作用研究方法 生物物理学方法 串联亲和纯化 免疫共沉淀 co immunoprecipitation CO IP 当细胞在非变性条件下被裂解时 完整细胞内存在的许多蛋白质 蛋白质间的相互作用被保留了下来 如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X 那么与X在体内结合的蛋白质Y也可能沉淀下来 蛋白质Y的沉淀是基于与蛋白质X的物理性相互作用 称为免疫共沉淀 Westernblot 变性抗原 主要用于检测蛋白质的存在与否 免疫共沉淀 非变性抗原 用于鉴定不同蛋白质间的相互作用 多采用非离子变性剂 NP40或TritonX 100 免疫共沉淀检测蛋白质的原理和常见问题 Y A B A Y B Y 非特异性 实验过程 实验过程 1 加入适量细胞裂解缓冲液 含蛋白酶抑制剂 冰上裂解30min 细胞裂解液于4 C 最大转速离心30min后取上清 2 取少量裂解液以备Westernblot分析 剩余裂解液加1 g相应的抗体加入到细胞裂解液 4 C缓慢摇晃孵育过夜 3 取10 lproteinA琼脂糖珠 用适量裂解缓冲液洗3次 每次3 000rpm离心3min 4 将预处理过的10 lproteinA琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4 C缓慢摇晃孵育2 4h 使抗体与proteinA琼脂糖珠偶连 5 免疫沉淀反应后 在4 C以3 000rpm速度离心3min 将琼脂糖珠离心至管底 将上清小心吸去 琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3 4次 最后加入15 l的2 SDS上样缓冲液 沸水煮5分钟 6 SDS PAGE Westernblotting或质谱仪分析 实验关键 1 实验最需要注意点就是抗体的性质 抗体不同和抗原结合能力也不同 特别是多抗的特异性是问题 2 为防止蛋白的分解 修饰 溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂 低温下进行实验 3 考虑抗体 缓冲液的比例 抗体过少就不能检出抗原 过多则就不能沉降在beads上 残存在上清 缓冲剂太少则不能溶解抗原 过多则抗原被稀释 主要用于 两种感兴趣蛋白质是否在体内存在相互作用 也用于鉴定一个特定蛋白质的未知相互作用蛋白 注意 1要求在一系列清洗过程中保持蛋白质复合体不变 因为出现假阳性的概率比较高 2设置的对照 在对照组中使用对照抗体 以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等 Westernblot 1 电转移效率2 PVDF膜的充分浸润3 转移液中有太多的SDS4 膜的损坏5 转移时胶和膜没有完全接触6 抗体的问题7 抗体的浓度太高或太低8 还原性物质的存在9 封闭不充分 优点 1 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的 处于天然状态 2 蛋白的相互作用是在自然状态下进行的 可以避免人为的影响 3 可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物 缺点 1 可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质 蛋白质相互作用 2 两种蛋白质的结合可能不是直接结合 而可能有第三者在中间起桥梁作用 3 如用westernblot检验 必须在实验前预测目的蛋白是什么 以选择最后检测的抗体 若预测不正确 实验就得不到结果 方法本身具有冒险性 灵敏度不如亲和色谱高 GSTpull down技术1988年Smith等利用GST融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白 从此GST融合蛋白在研究蛋白质相互作用领域得到极大推广 His也常用 此方法是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术 还应当在体内用单独的方法 如免疫共沉淀加以证实 靶蛋白X基因亚克隆到带有GST基因的原核表达载体中 并在细菌中表达GST融合蛋白 GST X 把GST融合蛋白 探针 诱饵蛋白 挂到带有GST底物的Sepharosebeads上 然后把另一种含目的蛋白质 捕获蛋白 的溶液加入其中 由于谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白 如发生相互作用则形成复合物 GST X Y 沉淀收集下来 洗脱非特异结合的蛋白后采用SDS PAGE鉴定与诱饵蛋白质相互作用的蛋白质 原理 GST PulldownAssay 右 对照 中间翻转混合时发生相互作用 胶上只与GST融合蛋白结合而不与GST结合的特异性条带表示新的相互作用蛋白 GSTpulldown GSTFusionProteinPurification GSTpulldown GSTfusionprotein不够纯 用作bait会产生太多的非特异性蛋白质污染 检测GST融合蛋白与靶蛋白相互作用 1 放射性标记融合蛋白 快速简单易行2 抗GST抗体检测3 生物素标记融合蛋白 没有放射性 但可能对探针蛋白和其他蛋白的相互作用有影响 应用 一确定融合 或探针 蛋白与未知 或靶 蛋白间的新的相互作用 一是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用 特点 比较简便 如果用抗GST抗体检测或生物素标记融合蛋白避免了使用同位素等危险物质 在蛋白质相互作用研究中有很广泛的应用 融合蛋白具有高通量性 高选择性的特点 由于融合蛋白的多样性以及表达系统的多样性 如细菌 果蝇 哺乳动物 该方法能够研究蛋白质在复杂体系中的相互作用 注意 该方法的成功应用取决于是否能够得到足够多 并且保持蛋白质活性的重组融合蛋白 且无过度降解 探针蛋白变成不同降解产物的混合物 和不溶 以及如何避免内源性诱饵蛋白的干扰 串联亲和纯化 TAP 近年来质谱技术发展迅速 其功能强大且灵敏度高 常用来鉴定相互作用的蛋白质复合体或复合体亚基 但通常难以获得足够量纯化的蛋白质复合体 成为质谱在这方面应用的一个限速步骤 1999年Rigaut 德国 等人共同提出了一套分离复合蛋白的新方法 串联亲和纯化 Tandemaffinitypurification TAP 兼具标准亲和纯化 可以得到高纯度地拷贝数的蛋白质复合体 和免疫共沉淀 用于特异性的标记蛋白与亲和柱之间的相互作用 两种生化方法的优点 为蛋白质复合体的分离鉴定提供了一条新路径 适用 研究蛋白质复合体中多个蛋白质间的相互作用 特别适用于研究蛋白质在生理条件下的相互作用 首先通过基因工程给被分离纯化蛋白的一端加一个TAP标签 该标签由IgG结合结构域 ProtA 及一个钙调蛋白结合多肽 CBP 组成 结构域与多肽之间由一个TEV蛋白酶切位点隔开 原理方法 1 基因重组将细胞内源性的目标蛋白基因置换为带有TAP标签的基因 温和裂解细胞 获取细胞抽提物 2 将抽提物加入IgG亲和柱 TAP标签的ProtA端会与IgG形成强结合 在用洗脱液洗脱掉大部分非特异性结合物和杂蛋白 实验流程 3 含有TEV蛋白酶的洗脱夜将蛋白质复合体切割下来 在钙离子参与下 被切割下来带有CBP的蛋白质复合体与钙调蛋白紧密结合 充分洗脱 就可以进一步去除非特异作用的蛋白质杂质 最后纯化出高纯度的目的蛋白复合体 4 经过串联亲和纯化的目的蛋白 通过SDS PAGE或者双向电泳分离之后 找出与目的蛋白相互作用的蛋白质 采用质谱分析的方法对其进行分析鉴定 MammalianTap tag LC MS MSmethod TAP优点加工和修饰过的蛋白可以作诱饵 相互作用发生在天然环境和细胞部位 一次操作可以分离和分析多组分的复合物 得到广泛应用 由于TAP标签的高度特异性以及采用两步洗脱纯化法 在纯化过程中不需要强烈冲洗 因此可以更好地保持较不稳定的蛋白质复合物 而且非特异蛋白的量也会很低 这是一步纯化法所不能比拟的 克服了双杂交筛选步骤复杂 假阳性结果较多 难于量化 不能满足大规模蛋白质组研究需要的缺陷 TAP缺点更倾向于高丰度和稳定的相互作用 许多低亲和力 瞬时和依赖特殊细胞环境的相互作用可能检测不到 另外 TAP必须采用能产生表达TAP标签的蛋白 这种标签蛋白的表达最好接近生理水平 所以最好将带标签的基因用天然启动子表达 但在哺乳动物细胞中 天然启动子表达标签蛋白是非常困难的 其表达水平不同于无标签的内源蛋白 由非生理水平的诱饵蛋白而产生假阳性 亲和纯化 affinitypurification 纯化 抗体Epitope tag flag myc HA V5 GST 核酸Pull downImmunoprecipitationTAP TandemAffinityPurification 酵母双杂交 Yeasttwo hybrid 1989年Field等发明了酵母双杂交系统 该系统利用了酵母的生长转录因子GAL4含有的两个结构域 DNA结合域 DNAbindingdomain BD 及转录激活域 activationdomain AD 将已知基因 诱饵基因 和靶基因或含有靶基因的cDNA分别构建在含BD及AD质粒载体上 将这两种质粒共同转化酵母感受态细胞 若BD结合的诱饵蛋白能够与AD结合的靶蛋白或文库中某些cDNA编码的蛋白相互作用 彼此间结合时 则会导致位于侧翼的BD与AD在空间上接近 呈现GAL4转录因子的完全活性 启动下游的报告基因如His及LacZ等基因的表达 从而在特定的缺陷培养基上生长 一 酵母双杂交系统基本原理 典型的真核生长转录因子 如GAL4 GCN4 等都含有二个不同的结构域 DNA结合结构域 DNA bindingdomain 和转录激活结构域 transcription activatingdomain 前者可识别DNA上的特异17bp长序列 UAS 并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游 转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用 启动它所调节的基因的转录 His gal BD和AD功能上相互独立又互相依赖 只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录因子活性 据此可将两个待测蛋白 X和Y 分别与这两个结构域建成融合蛋白 BD X和AD Y 并共表达于同一个酵母细胞内 如果两个待测蛋白间能相互作用 就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子 并激活相应的报告基因表达 通过对报告基因的检测就可很容易知道待测分子间是否发生了相互作用 进一步用已知蛋白X作为诱饵 分离获得与之相互作用的蛋白质Y及其编码序列 His gal 二 酵母双杂交系统组成 与BD融合的蛋白表达载体诱饵蛋白baitprotein与AD融合的蛋白表达载体靶蛋白preyprotein带有多个报告基因的宿主菌株HIS3 URA3 LacZ和LEU2等 报告基因 LacZreporter Blue WhiteScreeningHIS3reporter ScreenonHis media usuallyneedtoadd3ATtoincreaseselectivity LEU2reporter ScreenonLeu mediaADE2reporter ScreenonAde mediaURA3reporter ScreenonUra media candonegativeselectionbyaddingFOA X 半乳糖苷酶蓝白斑显色分析 举例 X BD Y AD X BD gal4 AD Gal4 BD Y AD gal4 BD gal4 AD Yeasttwo hybrid 酵母双杂交 应用 发现新的相互作用蛋白质鉴定和分析已有的蛋白质间的相互作用确定蛋白质间相互作用的功能基团 发现新的相互作用蛋白质 文库筛选的步骤 1 将待测基因与Gal4或LexA或其他合适蛋白的DNA结合域融合构建诱饵质粒 2 将诱饵质粒转化缺乏报告基因启动子的酵母细胞株中 选择被转化的酵母 3 再将文库质粒转化到酵母中 4 通过报告基因的功能筛选相互作用的蛋白 确定蛋白质间相互作用的功能基团 ProteinA AD 3 白兰白白 鉴定和分析已有的蛋白质间的相互作用 兰 相互作用白 不相互作用 序列分析 从酵母中分离质粒然后转化E coli从大肠杆菌中提取质粒并测序在数据库中比对所测定序列与已知蛋白的同源性 酵母双杂交测序结果 酵母双杂交得到的阳性克隆子质粒经过DNA测序 由NCBI数据库的BLAST检索cDNA编码的蛋白质 举例 测序结果查询过程 cDNA序列 NCBI BLAST Nucleotide megablast search format results Blast 举例 Results 举例 优点 1 快速获得相互作用蛋白的基因2 只需单一步骤的质粒构建3 检测在真核活细胞内进行 在一定程度上代表细胞内的真实情况 4 作用信号是在融合基因表达后 在细胞内重建转录因子的作用而给出的 省去了纯化蛋白质的繁琐步骤 5 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应 因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用 6 酵母双杂交系统可采用不同组织 器官 细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库 能分析细胞浆 细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白 7 通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大 同时 酵母表型 X Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感 局限性 1 双杂交系统分析蛋白间