动物肝脏DNA提取和鉴定-实验技术.ppt

动物肝脏DNA的制备和鉴定 甘肃中医药大学 核酸的分类 DNA 脱氧核糖核酸 主要存在于细胞核的染色体中 核外也有少量DNA 如线粒体DNA mtDNA 叶绿体DNA cpDNA 质粒DNA RNA 核糖核酸 存在于细胞质中 如mRNA rRNA tRNA等 除上述DNA RNA外 还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体 其或只含DNA 或只含有RNA 核酸的理化性质 在细胞内通常与蛋白质结合 以复合物形式存在 微溶于水 不溶于乙醇 氯仿等有机溶剂 在酸性溶液中容易降解 在中性或弱碱性溶液中较稳定 DNA溶液粘度很大 RNA的粘度较小 在强大离心力的作用下 可以从溶液中沉降下来 浓盐法 利用RNA和DNA在不同盐浓度溶液中的溶解度不同将二者分离 离子去污剂法 利用SDS CTAB 十六烷基三甲基溴化铵 等去污剂使蛋白质变性 直接从生物材料中提取DNA 苯酚抽提法 苯酚既是蛋白变性剂 又能抑制DNase的降解 用苯酚处理匀浆液时 由于蛋白与DNA连接键已断 蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶 蛋白分子溶于酚相 而DNA溶于水相 基因组DNA的提取方法 核酸制备中常用的去垢剂核酸本身带负电荷 结合带正电荷的蛋白质 用于核酸提取的去垢剂 一般都是阴离子去垢剂 去垢剂的作用 1 溶解膜蛋白及脂肪 使细胞膜破裂 2 溶解核糖体上面的蛋白质 使其解聚 将核酸释放出来 3 对RNase DNase有一定的抑制作用 如 SDS 脱氧胆酸钠 4 氨基水杨酸钠 萘 1 5 二磺酸钠 三异丙基萘磺酸钠 作用 1 使蛋白质变性 沉淀 从核酸提取液中分离除去 以防造成蛋白污染 2 某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用 如 苯酚 氯仿 盐酸胍 DEPC 核酸制备中常用的蛋白质变性剂 核酸制备中常用的酶DNase 降解DNARNase 降解RNA蛋白酶K 降解蛋白质溶菌酶 破碎细胞 核酸提取的主要步骤 沉淀核酸 去除盐类 有机溶剂等杂质 除去与核酸结合的蛋白质以及多糖 脂类等生物大分子 酚 氯仿抽提 蛋白变性剂 SDS 异硫氰酸胍等 蛋白酶处理 高盐洗涤 除去其它不需要的核酸分子 破碎细胞 研磨 组织匀浆 超声 冻融 异硫氰酸胍 碱裂解 酶解 溶菌酶 注意事项 加入RNA降解酶除RNA 加入DNA酶抑制剂 柠檬酸 氰化物 砷酸盐 EDTA SDS 苯酚等 蛋白变性剂反应不宜过于剧烈 避免过酸 过碱及高温 一 实验目的 1 学习并掌握用浓盐法从动物组织中的提取DNA方法及其原理 2 学习和掌握二苯胺法测定DNA的原理和方法 二 实验原理 核酸在真核细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在 用DNP和RNP表示 DNA Pro DNP 细胞核RNA Pro RNP 核仁及细胞质 溶于高盐溶液 1mol L 微溶于低盐溶液 0 14mol L 溶于低盐溶液 0 14mol L 微溶于高盐溶液 1mol L 核酸含量的测定方法 紫外吸收法 定磷法和分别针对DNA和RNA的颜色反应方法 脱氧核糖核酸中的脱氧核糖在酸性环境中变成 羟基 酮基戊醛与二苯胺试剂一起加热产生蓝色化合物 在595nm处有最大的吸收 DNA20 400微克范围内 光密度与DNA的浓度成正比 在反应液中加入少量乙醛 可以提高反应的灵敏度 13 可编辑 三 实验试剂 95 冷乙醇 NaCl固体 二苯胺 称取纯二苯胺1g溶于100ml冰醋酸中 加入10ml过氯酸 混匀 临用时加1ml1 6 乙醛溶液 所配置试剂应为无色 0 14mol LNaCl 0 05mol L柠檬酸钠缓冲液 PH 6 8 DNA标准液200ug ml DNA钠盐用5mmol L的NaOH配制 氯仿 异戊醇 20 1 V V 5 SDS 组织捣碎匀浆机 除去蛋白质的方法 SDS 十二烷基硫酸钠 等去污剂使蛋白质变性 可以直接从生物材料中提取DNA 防止DNA酶的降解 提取时可加入适量EDTA 乙二胺四乙酸 柠檬酸 以降低DNA酶的活性 氯仿一异成醇使蛋白质变性 离心除去变性蛋白质 DNA的定量测定 DNA粗品用5mmol LNaOH溶解并定容至50ml 作为待测品 混匀 60 水浴保温45min 冷却后 595nm处 比色 以吸光度A595nm对DNA含量 ug 作图 绘制标准曲线 从标准曲线上查出样品的DNA含量 计算100g猪肝中DNA的含量 待测样品中DNA的质量 25 稀释倍数 称取猪肝的质量 匀浆 破碎细胞 要充分 需剪成小块 固体NaCl应磨碎 加入应分批缓慢加入 边加边摇 避免局部浓度过大或者未及溶解而