实验三 食品中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）.doc

实验三 食品中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）（50095-2003食品中蛋白质含量测定）一、目的与要求1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。2、掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。二、实验原理蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。三、仪器与试剂（一）试剂1、硫酸铜（CuSO45H20） 2、硫酸钾3、硫酸（密度为1.8419g/L）4、硼酸溶液（20g/L）5、氢氧化钠溶液（400g/L）6、0.01mol/L盐酸标准滴定溶液。7、混合指示试剂：0.1%甲基红乙溶液液1份，与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液5份临用时混合。8、黄豆粉。（二）仪器微量定氮蒸馏装置：如图3- 所示。 图3- 微量凯氏定氮装置1、电炉； 2、水蒸气发生器（2L平底烧瓶）；3、螺旋夹a；4、小漏斗及棒状玻璃塞（样品入口处）；5、反应室；6、反应室外层；7、橡皮管及螺旋夹b；8、冷凝管；9、蒸馏液接收瓶。四、实验步骤1、样品消化称取黄豆粉约0.3g（0.001g），移入干燥的100mL凯氏烧瓶中，加入0.2g硫酸铜和6g硫酸钾，稍摇匀后瓶口放一小漏斗，加入20mL浓硫酸，将瓶以450角斜支于有小孔的石棉网上，使用万用电炉，在通风橱中加热消化，开始时用低温加热，待内容物全部炭化，泡沫停止后，再升高温度保持微沸，消化至液体呈蓝绿色澄清透明后，继续加热0.5h，取下放冷，小心加20mL水，放冷后，无损地转移到100mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀备用，即为消化液。试剂空白实验：取与样品消化相同的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸，按以上同样方法进行消化，冷却，加水定容至100mL，得试剂空白消化液。2、定氮装置的检查与洗涤检查微量定氮装置是否装好。在蒸气发生瓶内装水约三分之二，加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠（或沸石）以防止暴沸。测定前定氮装置如下法洗涤23次：从样品进口入加水适量（约占反应管三分之一体积）通入蒸汽煮沸，产生的蒸汽冲洗冷凝管，数分钟后关闭夹子a，使反应管中的废液倒吸流到反应室外层，打开夹子b由橡皮管排出，如此数次，即可使用。3、碱化蒸馏量取硼酸试剂20mL于三角瓶中，加入混合指示剂23滴，并使冷凝管的下端插入硼酸液面下，在螺旋夹a关闭，螺旋夹b开启的状态下，准确吸取10.0mL样品消化液，由小漏斗流入反应室，并以10mL蒸馏水洗涤进样口流入反应室，棒状玻塞塞紧。使10mL氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，用少量水冲洗立即将玻塞盖坚，并加水于小玻杯以防漏气，开启螺旋夹a，关闭螺旋夹b，开始蒸馏。通入蒸汽蒸腾10min后，移动接收瓶，液面离开凝管下端，再蒸馏2min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下三角瓶，准备滴定。同时吸取10.0mL试剂空白消化液按上法蒸馏操作。4、样品滴定以0.01mol/L盐酸标准溶液滴定至灰色为终点。5、数据记录项 目第一次第二次第三次样品消化液（mL）滴定消耗盐酸标准溶液（mL）消耗盐酸标准溶液平均值（mL）五、结果计算式中 X样品蛋白质含量（g/100g）；V1样品滴定消耗盐酸标准溶液体积（mL）；V2空白滴定消耗盐酸标准溶液体积（mL）；c盐酸标准滴定溶液浓度（mol/L）；0.0140 1.0mL盐酸标准滴定溶液相当的氮的质量（g）；m样品的质量（g）；F氮换算为蛋白质的系数，一般食物为6.25；乳制品为6.38；面粉为5.70；高梁为6.24；花生为5.46；米为5.95；大豆及其制品为5.71；肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵5.30。计算结果保留三位有效数字。六、注意事项及说明1、本法也适用于半固体试样以及液体样品检测。半固体试样一般取样范围为2.00g5.00g；液体样品取样10.0mL25.0mL（约相当氮30mg40mg）。若检测液体样品，结果以g/100mL表示。2、消化时，若样品含糖高或含脂及较多时，注意控制加热温度，以免大量泡沫喷出凯氏烧瓶，造成样品损失。可加入少量辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂减少泡沫产生。3、消化时应注意旋转凯氏烧瓶，将附在瓶壁上的碳粒冲下，对样品彻底消化。若样品不易消化至澄清透明，可将凯氏烧瓶中溶液冷却，加入数滴过氧化氢后，再继续加热消化至完全。4、硼酸吸收液的温度不应超过40，否则氨吸收减弱，造成检测结果偏低。可把接收瓶置于冷水浴中。5、在重复性条件下获得两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%七、思考题1、预习凯氏定氮法测定蛋白质的原理及操作。2、蒸馏时为什么要加入氢氧化钠溶液？加入量对测定结果有何影响？3、在蒸汽发生瓶水中、加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸的作用是什么？若在蒸馏过程中才发现蒸汽发生瓶中的水变为黄色，马上补加硫酸行吗？4、实验操作过程中，影响测定准确性的因素有哪些？小学常用歇后语1.八仙过海-各显神通 2.不入虎穴-焉得虎子3.蚕豆开花-黑心 4.车到山前-必有路5.打破砂锅-问到底 6.和尚打伞-无法无天7.虎落平阳-被犬欺 8.画蛇添足-多此一举9.箭在弦上-不得不发 10.井底青蛙-目光短浅11.大海捞针-没处寻 12.竹篮打水-一场空13.打开天窗-说亮话 14.船到桥头-自会直15.飞蛾扑火-自取灭亡 16.百米赛跑-分秒必争17.拔苗助长-急于求成 18.仇人相见-分外眼红19.芝麻开花-节节高 20.新官上任-三把火21.瞎子点灯-白费蜡 22.兔子尾巴-长不了23.偷鸡不成-蚀把米 24.王婆卖瓜-自卖自夸25.老虎屁股- 摸不得 26.老虎拉车-谁敢27.老鼠过街-人人喊打 28.麻雀虽小-五脏俱全29.墙上茅草-随风两边倒 30.三十六计-走为上计31.塞翁失马-焉知祸福 32.壶中无酒-难留客33.丈二和尚-摸不着头脑 34.有借有还-再借不难35.猫哭耗子-假慈悲 36.铰子破皮-露了馅37.扁担挑水-一心挂了两头 38.对牛弹琴-白费劲39.八仙聚会-神聊 40.霸王敬酒-不干也得干41.板上订钉-跑不了 42.背鼓上门-讨打43.草把做灯-粗心（芯） 44.竹笋出土-节节高45.菜刀切豆腐-两面光 46.钉头碰钉子-硬碰硬47.高山上敲鼓-四面闻名（鸣） 48.铁打的公鸡-一毛不拔49.关公走麦城-骄必败 50.狗咬吕洞宾-不识好人心51.鸡蛋碰石头-不自量力 52.姜太公钓鱼-愿者上钩53.脚踏西瓜皮-滑到哪里是哪里 54.孔夫子搬家-净是书55.老鼠钻风箱-两头受气 56.留得青山在-不怕没柴烧57.门缝里看人-把人看扁了 58.泥菩萨过河-自身难保59.泼出去的水-收不回 60.骑驴看唱本-走着瞧61.千里送鹅毛-礼轻情意重 62.肉包子打狗-有去无回63.山中无老虎-猴子称大王 64.司马昭之心-路人皆知65.外甥打灯笼-照旧（舅） 66.王八吃年糕-铁了心67.王小二过年-一年不如一年 68.小葱拌豆腐-一清二白69.小和尚念经-有口无心 70.周瑜打黄盖-两厢情愿71.赶鸭子上架-吃力不讨好 72.擀面杖吹火- -一窍不通73.瞎子戴眼镜-装饰 74.猴子捞月亮-空忙一场75.秀才遇到兵-有理讲不清 76.三个臭皮匠-顶个诸葛亮77.黄牛追兔子-有劲使不上 78.和尚训道士-管得宽79.过年娶媳妇-双喜临门 80.聋子见哑巴-不闻不问六字短语81.铜钣上钉铆钉-一是一，二是二 82.里弄里扛竹竿-直来直去83.苦水里泡黄连-苦上加苦 84.驴唇不对马嘴-答非所问85.猪鼻子里插葱-装象 86.只许州官放火-不许百姓点灯87.猪八戒照镜子-里外不是人 88.放风筝断了线-没指望了