猪肉质性状基因遗传标记的研究进展.doc

目 录1 猪肉质性状的主效基因11.1 猪氟烷基因11.2 猪酸肉基因11.3 单磷酸腺苷蛋白激酶3亚基基因22 猪肉质性状的主要候选基因22.1 脂肪酸结合蛋白基因32.2 激素敏感脂肪酶基因32.3 酯蛋白脂肪酶基因32.4 MyoD 基因家族32.5 钙蛋白酶抑制蛋白基因42.6 黑素皮质素受体42.7 肥胖基因42.8 肌生成抑制蛋白基因52.9 ACSL基因52.10 过氧化物酶体增殖物活化受体基因52.11编码腺苷磷酸脱氨酶基因52.12 固醇调节元件结合蛋白1基因53 基因遗传标记的研究与应用策略63.1 候选基因分析( candidate genes approach)63.2 标记辅助选择( marker assisted selection ，MAS)63.3 标记辅助渗入( marker assisted introgression ，MAI)74 结语与展望7参考文献8猪肉质性状基因遗传标记的研究进展随着人民生活水平的提高，消费者对于食品品质认识的提高促使肉品加工业和零售业更加重视肉品的质量。分子生物学技术的发展也让研究者认识到基于DNA标识的选育是最有效的选育手段。如果相应性状不能用一定的标记进行识别就得将动物养育到正常屠宰月龄屠宰后才能检测分析相应性状，费时费力且成本高。如果发现某一DNA标记（如多态性）和目标性状有联系就可以对年幼的动物进行基因型研究而不必等到屠宰时，并且可以敲除对性状有害的基因改良品种性状。分子标记选育技术要能够持续地用于动物育种必须在我们发现使用现有的标记已经不能满足要求的情况下能够发现新的标记。经过长时间建立的数据库是发现新的标记和检测候选基因的宝贵资源。因此与肉质相关基因的研究显得尤为重要。近年来，采用分子生物学技术对影响猪肉质性状的主效基因、候选基因及QTL定位已取得迅猛发展，下面就有关猪肉质性状基因及QTL定位的研究进展作扼要概括。1 猪肉质性状的主效基因1.1 猪氟烷基因氟烷基因（halothanegene，HAL）也称为应激基因、钙释放槽基因或斯里兰卡肉桂碱受体基因。名词“氟烷基因”的应用来自使用氟烷麻醉气体测试猪的一种特征性反应，有些肌肉极其丰满的猪发生这种反应，反应的表现为肌肉强直，体温升高。氟烷反应猪的基因是隐性纯合个体（Halnn），在应激情况下易产生应激综合症（porcine stresssyndrome，PSS），形成灰白水样（pale，soft，exudative，PSE）的劣质肉。Fuji等研究发现HAL基因为PSE肉的主效基因，即位于猪染色体6q1.11.2的兰尼定受体1基因（ryanodine receptor1，RYR1）或称Ca2+释放通道基因（calcium release channel，CRC），该基因的第1843个碱基胞嘧啶C突变为胸腺嘧啶T，导致蛋白受体第615位上的精氨酸被半胱氨酸代替，从而引起受体的结构和功能发生改变1。这种改变导致应激状态下Ca2+大量非正常释放，引起电解质代谢混乱，出现肌肉持续收缩，使猪产生恶性高热。大量释出的Ca2+激活过量的糖原酵解，使肌糖原酵解过程加速，引起肌肉pH值异常降低，导致PSE肉产生。目前已经建立了PCRRFLP和PCR-SSCP方法检测氟烷基因，并有基因诊断盒上市，用于猪的育种实践2。1.2 猪酸肉基因酸肉基因又叫RN基因(Rendement Napole or gene RN)，是影响肉质的另一主效基因。酸肉状态原来是法国一个汉普夏猪研究组鉴定的。迄今为止，这个基因仅见于纯汉普夏或汉普夏品系中。RN基因有2个等位基因，不利等位基因RN-是正常等位基因rn的完全显性3，该基因定位于15q2.42.5区间内，其显性等位基因有增加肌糖原含量，降低腌制和烹饪火腿产量的效益，并引起猪肉酸化4。Mariani等在酸肉发生机理的系列研究中发现，在PRKAG3基因外显子3中碱基GA的突变抑制了特异磷酸蛋白激酶(adenosine monopHopHate-activated kinase)的活性，从而中止糖原的积蓄，导致了酸肉的产生，利用这一突变可以准确地检测RN基因。1.3 单磷酸腺苷蛋白激酶3亚基基因AMPactivated Protein Kinase 3基因:是近年来被发现的一个影响猪肉pH 值、肉色及系水力的主效基因，有多个突变位点，其中第200个密码子发生突变(Arg200Gln200)是引起RN 效应的根本原因，这个R200Q突变导致RN/RN和RN/rn+动物的肌肉糖原含量提高了70%，猪被屠宰之后24小时测定肌肉的pH值较低，肌肉系水力下降，烤制火腿的产量也降低。这个200Q等位位点与所有RN型动物有关，并在汉普夏品种中有很高的比例，但不存在于rn+基因型或其它品种猪中。T32N、G52S和I199V 突变广泛存在于一些商业猪品种中，与优良肉质性状有关5。AMPK是一种能被腺苷一磷酸（AMP）激活的蛋白激酶，被激活的AMPK主要通过改变机体内脂类和糖类代谢，使其朝着抑制ATP消耗、促进ATP生成的方向进行，从而保持体内能量平衡。AMPK是由、和三个亚基构成的异源三聚体。为催化亚基，有1和2两种同工型。和为调节亚基，亚基有1和2两种同工型，亚基有1、2和3三种同工型。其中PRKAA1和PRKAA2分别编码1和2亚基；PRKABl和PRKAB2分别编码1和2亚基；PRKAG1、PRKAG2 和PRKAG3 分别编码1、2 和3 亚基6。Milan等7首次报道汉普夏猪PRKAG3基因第200个密码子发生突变（Arg200Gln200），使AMPK活性降低，从而使骨骼肌中糖原含量升高70%，最终导致猪肉终pH降低是引起RN效应的根本原因。Ciobanu8、Fontanesi9-10、Lindahl11-12、Otto13、Lu-Sheng Huang等14的研究都表明：PRKA G3编码亚基中的其他三个氨基酸（T30N，G52S，I119V）的替换对肉质都有不同程度的影响，其中紧邻Arg200的Val199Ile199突变具有与RN相反的效应，它使骨骼肌中糖原含量降低，因而有利于改善肉质。PRKA G3是近年来确定的一个影响肉质pH、肉色及系水力的主效基因。李梦云等15的研究表明PRKA G3基因在雅南猪和杜长大三元杂交猪中的表达率与屠宰率、眼肌面积和背膘厚关系不大而和肌内脂肪含量成正相关。另外，王金雷等16的研究表明鸡PRKAB2基因第一外显子406bp处发生的TC的突变可显著提高活重、屠体重、腿肌重和腹脂重，同时提高肉的嫩度。Hae-Young Lee等17的研究表明PRKAA2基因可能与动物脂肪沉积有关。2 猪肉质性状的主要候选基因作为猪肉质性状的主要候选基因（cadidate gene）通常是一些已知其生物学功能和核苷酸序列的基因，它们参与肉质性状发育过程。这些基因可能是结构基因、调节基因、或在生化代谢途径中影响肉质性状表达的基因。2.1 脂肪酸结合蛋白基因脂肪酸结合蛋白（fatty acid-binding proteins，FABPs）家族是存在于许多细胞类型中细胞溶质内的脂肪酸结合蛋白，至少有11种结构上不同的类型，其中心脏脂肪酸结合蛋白（H-FABP）基因被定位在猪6号染色体上，主要在心脏、骨骼肌细胞和乳腺细胞表达，对肌肉脂肪含量（IMF）有显著的影响。脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白（A-FABP）基因被定位在猪4号染色体上，主要在脂肪细胞中表达，与肌内脂肪的分化积累有关。因此H-FABP和A-FABP基因均可作为IMF的候选基因。通过QTL遗传分析发现，与IMF有关的QTL位点极有可能存在于A-FABP基因的微卫星区域内，此位点已被精确定位于4号染色体上的65cM处，而在HFABP两个等位基因的微卫星位点内却没有发现IMF显著增加18。2.2 激素敏感脂肪酶基因激素敏感脂肪酶(hormone sensitive lipase，HSL)能将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸以满足动物体的需要，是甘油三酯合成和分解的限速酶。哺乳动物体内的脂肪常以甘油三酯的形式储存于脂肪细胞内，Gu等利用鼠 HSLcDNA探针进行原位杂交，把猪的HSL基因定位于染色体的6p12-21区域内，猪HSL基因编码的氨基酸序列与人和鼠同源性为85% ，猪HSL 基因的全长序列有11kb，含有9个外显子，基因全长已被克隆和测序（Chowdhary等）。王琦等研究了HSL基因的多态性后认为，HSL基因可以初步被看成是影响猪脂肪沉积性状的重要候选基因之一，并发现了SSCP多态位点19。2.3 酯蛋白脂肪酶基因酯蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase，LPL)基因是催化与蛋白质相连的甘油三脂水解作用的酶，它可将血液中乳糜粒和极低密度酯蛋白所携带的甘油三脂分解成甘油和脂肪酸，向脂肪组织提供合成甘油三脂所需的原材料，以供各组织储存和利用。廉红霞等20对杜长白大约克猪的研究表明猪生长育肥期背最长肌LPL基因表达与肌内脂肪含量呈显著正相关。王刚等21对莱芜猪和鲁莱猪的研究表明猪肌肉组织LPL是肌内脂肪沉积的重要参与者，其编码基因的表达具有明显的体重发育特征，并对肌内脂肪的沉积具有一定程度影响。因此，LPL是动物组织沉积脂肪关键酶，肌体中的脂肪组织和骨骼肌中含有丰富的酯蛋白脂肪酶。猪的LPL基因已被定位在14号染色体的q1.2-1.4上。Previato等研究表明，LPL基因的5端上游区域-368- -35之间为基因的正调控区，-724- -565为负调控区，它们影响基因的表达，从而影响脂肪沉积。鉴于LPL在动物脂肪代谢中的关键作用，猪的LPL基因可以看成是影响猪脂肪沉积的重要候选基因之一。2.4 MyoD 基因家族哺乳动物体肌纤维在胚胎形成过程中受到MyoD基因家族的调控。MyoD基因家族包括四种结构上相关的基因：MyoDI，肌细胞生成素（myogenin，MYOG），myf5和myf6。这些基因编码螺旋环螺旋（bHLH）蛋白，通过调解肌肉分化阶段特异蛋白的表达来参与肌细胞决定和分化，其中myf5和MyoDI在成肌细胞增殖过程中表达，MYOD在未分化末期表达。Myf 26是一个与MYOD有关的基因，MYOD在胎儿发育中起作用，myf 26在胎儿出生后最活跃，参与成年动物肌肉量形成的调节（Te Pas等）。myf5基因定位于5 号染色体上，而Myo D I 定位于2号染色体（Soumillion等）。MYOG基因控制启动成肌细胞融合和形成肌纤维，在肌肉分化过程中起关键作用。Soumillion等利用四种MyoDcDNA混合扫描猪基因组文库，确定了猪MyoD基因及其变异，MyoD基因有三个MspI多态位点。用猪/鼠杂交克隆板PCR的方法将MYOG位于9 号染色体上。2.5 钙蛋白酶抑制蛋白基因钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin，CAST)基因是一种特定的、内源性的、需钙激活的蛋白酶抑制剂，需钙蛋白酶的蛋白水解系统在细胞内普遍存在，并参与大量生长和代谢过程，Rettenberger等将CAST基因定位于2号染色体上，Ernst等进一步将其定位于2q2.12.4，并发现有三个PCRRFLP多态位点，在猪中，与发现该基因产物参与肌肉生产过程中蛋白质更新机制。而对于其他肉用家畜，已发现这个基因显著影响肉的嫩度22。2.6 黑素皮质素受体基因黑素皮质素受体（melanocortin receptors，MCRs）家族共有5个受体(MCR1MC5R).其中MC3R是一个神经受体，其主要功能是调节采食和能量平衡，MC4R基因是与人类显性遗传疾病肥胖相关的靶基因，该基因没有内含子，在哺乳动物的表达部位是下丘脑、淋巴系统、后脑、脑干、脊髓、肌肉、皮质，主要作用是控制食欲、体重、能量代谢。猪的MC4R基因的错义突变，属一个氨基酸改变编码的错义突变，可引起膘厚、体重和采食量显著变化。2.7 肥胖基因肥胖（obese，OB）基因位于常染色体上，呈隐性遗传，猪肥胖基因cDNA全长为3277bp，RT-PCR分析表明，猪肥胖基因不仅在脂肪组织中大量表达，同时也在肝、肾、脾、和心脏等器官组织有微量表达。猪肥胖基因的表达产物Leptin是一种能调节体内脂肪储存量、能量代谢及体重的内分泌因子，肥胖基因仅在成熟的脂肪细胞中表达，在调节肌体脂肪和体重稳态中具有特别重要的作用。戴茹娟等用人的肥胖基因cDNA做探针在脂肪型和瘦肉型猪品种中分离出Bg1II的RFLP，比较发现瘦肉型猪在肥胖基因座具有3.3kb的条带，脂肪型猪有4.1kb的条带。戴茹娟还发现Leptin在脂肪型猪的表达水平远高于瘦肉型猪，原因在于Leptin的表达与猪皮下脂肪积累有关。Leptin还可以通过血脑屏障进入下丘脑弓形核，通过减少阿黑色素原（proopiomelanocortin，POMC）的表达量，从而调节黑素皮质受体的作用。2.8 肌生成抑制蛋白基因 肌生成抑制蛋白基因(Myostatin）是转化生长因子(transforming growth factor，TGF)超家族的新成员。TGF由许多编码分泌性因子的基因组成，包括TGF、活化素(activin)、抑制素(inhibins)、骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMPs)、缪勒氏管抑制物(mullerian inhibitor substance，MIS)等，主要在调节胚胎发育和维持组织稳态方面发挥重要作用。Mstn对骨骼肌生长有重要调节作用，Mstn敲除的鼠肌纤维广泛增生、肥大，骨骼肌质量显著增加，平均体重超过正常鼠261%。随后的研究陆续发现Myostatin编码序列发生突变的牛、羊、猪、鱼、虾等也有骨骼肌质量增加现象。Mstn是骨骼肌生长的负调控因子。2.9 ACSL基因ACSL基因:为编码长链脂酰CoA合成酶(longchain acylCoA synthetase)的基因，长链脂酰CoA合成酶属于多基因家族编码的酶。一些研究发现，ACSL对猪体内脂肪代谢具有调节作用。猪ACSL4基因多态性与生长速度和油酸含量存在相关性。杜长大商品猪ACSL4基因多态性与6个肉质性状存在相关性，其中GG基因型个体的IMF极显著地高于AA基因型个体(p0.01)。2.10 过氧化物酶体增殖物活化受体基因 过氧化物酶体增殖物活化受体基因（PPAR）：为过氧化物酶体激活增殖受体基因超家族的重要成员，是核受体家族中最具脂肪细胞专一性的成员，是细胞分化的关键基因;在脂肪细胞分化诱导过程中是在大多数脂肪细胞特异性基因表达之前被诱导的，主要通过PPARRXR( retinoidx receptor)二聚体与靶基因上相应元件结合而调控基因的转录。PPAR基因位于6号染色体。PPAR对脂肪细胞的分化起正向调节作用，PPAR激活不仅能促进前体脂肪细胞分化成脂肪细胞，而且还能促进非脂肪细胞系细胞分化成脂肪细胞。PPAR蛋白在猪脂肪组织中的表达水平比在其他组织中高。因此，PPAR很可能对猪的脂肪生成及脂肪组织中激素的活动起重要作用。2.11编码腺苷磷酸脱氨酶基因编码腺苷磷酸脱氨酶基因( adenosine monophosphate deaminase，AMPD)：是一个与风味有关的候选基因。AMPD是嘌呤代谢过程中的一种重要酶，对肉质性状和风味都起到重要作用。AMPD基因主要在骨骼肌中高水平表达，与肌肉中肌苷酸代谢有关，一些研究发现，AMPD是影响猪肉品质的候选基因，还与猪的胴体性状有关。2.12 固醇调节元件结合蛋白1基因固醇调节元件结合蛋白1基因（ADD1）：又称，编码和调节脂肪细胞定向和分化因子1。ADD1主要影响糖代谢和脂肪代谢，它所编码的蛋白都有3个结构域：一是氨基末端的转录活化域，包含 碱性螺旋环螺旋亮氨酸拉链 的核心结构二是在中间有2个疏水结构域; 三是羧基末端的调节结构域。ADD1主要利用高尔基体的运送和加工释放出含碱性螺旋环螺旋亮氨酸拉链的核心结构氨基酸片断，然后与靶基因的启动子或固醇调节元件的E盒结合，调节相关基因的表达。其靶基因主要包括低密度脂蛋白(LDL)受体、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)、生长抑制因子(S14) 、葡萄糖激酶(GK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶(PEPCK)等有关脂肪合成和葡萄糖代谢的基因。胰岛素对一些基因的调控需要ADD1 的介导。3 基因遗传标记的研究与应用策略3.1 候选基因分析( candidate genes approach)候选基因分析是指根据在那些研究得较全面和深入的物种(如人类和鼠)中已发现的基因信息，寻找与之同源的基因作为候选基因，或通过分析与DNA序列相应的蛋白质结构来推测其功能，从而选取候选基因，研究这些基因在生理上或生长发育过程中能得以表现的性状差异与DNA差异之间的关系。实际上就是寻找与数量性状有关的主基因座位并用之于选种。而这些与数量性状直接有关的基因就是候选基因。例如: IMF含量是猪肉嫩度、风味和多汁性等食用品质的主要决定因素，而IMF的沉积又与脂肪酸的转运及脂肪的合成、分解等生理生化代谢机制有关，因此，可以将其代谢机制中有关蛋白质的表达基因作为候选基因。Gerbens等23于1997年发现H2FABP基因是制约猪IMF 含量变化的候选基因，并将其定位于6号染色体上。一年后又发A2FABP与IMF 的分化积累有关，同时将该基因定位于猪4号染色体上。美国Iowa研究组将CAST基因作为候选基因，研究其在肌肉生长和肉质方面所起的作用。目前，候选基因法是颇有吸引力的，因为它可以很快寻找到与QTL连锁的标记，而这QTL本身就是对性状表达有直接作用的功能基因座位。3.2 标记辅助选择( marker assisted selection，MAS)猪的肉质性状为复合性状(complex trait) ，包括肉色、pH值、系水力、肌内脂肪(大理石花纹) 、嫩度、多汁性和风味等。这些性状在度量过程中一定程度上存在着系统误差，而且在活体上无法直接度量，这就意味着必须使用昂贵的同胞测验才有助于育种工作。从这个意义上讲，用DNA标记进行辅助选择，对肉质改良是非常有意义的。研究表明猪的肉质性状的遗传力为中等至高，显然，这些性状被许多基因所控制，但一些基因可能起主要作用，即主基因效应。利用主效基因的遗传标记进行辅助选择能提高选择的准确性、缩短世代间隔、增加选择差等，可望加速这些性状的遗传进展。已有一些主基因正被选作分子育种的标记，如氟烷基因的MAS已被纳入无PSS皮特兰猪等的分子育种计划，并且国外已经育成无PSS皮特兰猪应用于生产。Schook LB等24将常规选择指数法与基因型选择法相结合，应用于军牧1 号白猪四、五世代核心群的选种中， 结果使应激敏感基因频率下降了12 % ，而四、五世代生产性能差异不显著，证明了两种方法的结合在猪育种实践中是有效的。但更多与肉质有关的基因无论是在基因效应还是在精确定位上都还达不到MAS的要求，在此方面还需要做进一步的深入研究。3.3 标记辅助渗入( marker assisted introgression，MAI)标记辅助渗入就是在QTL 检测和定位的基础上， 把特定的主基因或数量性状基因位点的等位基因在遗传标记的辅助下，从一个品种渗入到另一个品种，再用较优良的那个品种进行反复回交，直到该主基因或数量性状的等位基因达到一定频率的过程。基因渗入途径就是利用带有被渗等位基因的供体群体与受体群体进行多代回交，继而进行横交使目的基因纯合，在回交和横交固定的过程中，都是根据标记的信息来选择那些携带有导入基因的个体进行交配，从而使导入基因的效率大大提高。由于标记辅助渗入实质上是一种根据QTL或基因标记进行的回交，因此，它可以使受体群在目标性状表现性能得到提高的同时，尽量保留原有的大部分变异。在这种育种策略中，可能的收效在很大程度上依赖于QTL效应的大小和其在商品猪中的频率。标记辅助渗入方案的效率可用终端群体中被渗入基因的频率和有益经济性状的遗传进展来判断。4 结语与展望随着现代生物技术的不断发展，人们已经开始利用DNA标记对肉质性状进行辅助选择。但猪的肉质性状为复合性状，并且受很多因素的影响，在肉质性状的研究中还存在一些问题，如肉质评定标准不统一、肉质评定指标还不完善等。因此，我们应当继续研究肉质的遗传特性及评定方法; 寻找评价肉质的关键性状及其主效基因，探测其QTL 的遗传效应; 制定出完善的旨在肉质改良与肉量提高的MAS 和MAI 育种方案。用DNA 标记进行辅助选择，对肉质改良是非常有意义的。候选基因分析对于研究数量性状位点(QTL) 是颇具吸引力的，候选基因分析及MAS、MAI 在猪育种方法上的应用是一个飞跃，是数量遗传学与分子生物学相结合的产物，具有无限生命力。我们有理由相信，常规选择与现代生物技术相结合是培育品质优良、生产性能良好的新品系猪的必由之路。参考文献1 李梦云，陈代文，张克英影响猪肉质性状的基因及其表达调控J畜牧与兽医，2008，40(4):95992 郑云林，刘敬顺，刘小红猪肉品质性状评定和遗传改良研究综述J中国畜牧杂志，2004，40(12):42453 仇雪梅，李宁，邓学梅，等影响动物肉质性状主要候选基因的研究进展J遗传，2002，24 (5):5715744 曹果清，周忠孝，袁建霞，等猪主要经济性状的研究进展J遗传，2002，24(2) : 2142185 Elisabeth Le BihanDuval，Martine Debut，et alChicken meat quality: genetic variability and relationship with growth and muscle characteristicsJBMC Genetics，2008，8:16 6 Lindahl G，Enfalt A-C，von Seth G，et al. A second mutant allele（V199I） at the PRKAG3（RN） locus - I：Effect on technological meat quality of pork loinJ. Meat Science，2004，66：609-619.7 Denis Milan.A mutation in PRKAG3 associated with excessglycogen content in pig skeletal muscleJ. Science，2000，288：1248-1251.8 Ciobanu D，Bastiaansen J，Malek M，et al. Evidence for new alleles in the protein kinase adenosine monophosphate-activated gamma（3）-subunit gene associated with low glycogen content in pig skeletal muscle and improved meat qualityJ.Genetics，2001，159（3）：1151-1162.9 Fontanesi L，Davoli R，Nanni Costa L. Study of candidate genes for glycolytic potential of porcine skeletal muscle：identification and analysis of mutations，linkage and physical mapping and association with meat quality traits in pigs J.Cytogenetic and Genome Research，2003，102：145-151.10 Fontanesi L，Davoli R，L Nanni，et al. Investigation of candidate genes for glycolytic potential of porcine skeletal muscle：Association with meat quality and production traits in Italian Large White pigsJ. Meat Science，2008，80：7780-7787.11 Lindahl G，Enfalt A-C，von Seth G，et al. A second mutantallele（V199I）at the PRKAG3（RN）locus - I：Effect ontechnological meat quality of pork loinJ.Meat Science，2004，66：609-619.12 Lindahl G，Enfalt A-C，von Seth，et al. A second mutant allele（V199I）at the PRKAG3（RN）locus -II：Effect on colour characteristics of pork loinJ. Meat Science，2004，66：621-627.13 Otto G，Roehe R，Looft H et al. Association of DNA markers with meat quality traits in pigs with emphasis on drip loss J. Meat Science，2007，75：185-195.14 Lu-Sheng Huang，Jun-Wu Ma，Jun Ren，et al. Genetic variations of t