酶失活动力学ppt.ppt

酶的失活动力学 酶是一种不稳定的物质 常因温度 pH等因素的影响而产生不可逆的活力下降 一般胞外酶较为稳定 而胞内酶在外部环境中容易失活 酶在保存和参与反应时均可能失活 酶在保存过程中的失活又称为酶的稳定性 失活越快 说明酶的稳定性降低 酶的热失活是最重要的一种酶失活形式 下面主要讨论此种失活的动力学 一 未反应时的热失活动力学 测定酶未反应时的热失活动力学方法 在一定条件下 使酶溶液恒温保持一定时间 然后在最适宜的pH和温度下测定残存的酶活力 即残存酶活力 在不同温度下反复测定 即可得到一条曲线 该曲线可以表示酶的失活特性 称为酶的热失活曲线 若改变保温时间 则会得到不同的热失活曲线 图1 1 如果要了解酶在未反应时的失活速率 可将残存的酶活力对其失活时间作图 则又可得到一条曲线 图1 2 图1 1不同温度下的酶失活曲线 图1 2不同时间下的酶失活曲线 这些曲线反应了酶的生活规律 酶的热变性失活很复杂 一般将其分为可逆失活与不可逆失活两类 并提出了多种失活动力学模型 下面主要介绍一步失活模型 1 一步失活模型 onestepmodel 式中 E 活性酶D 失活酶kd 正反应的速率常数kr 负反应的速率常数 则活性酶的浓度随时间的净减少率或失活反应方程式可表示为 系统中酶的总浓度若以cE0表示 则存在下述关系式 cE0 cEt cD a b 将式 b 代入式 a 并利用边界条件t 0 cE0 cEt积分 经整理可得下式 c 对不可逆失活反应 kr 0 可得cEt cE0exp kdt d 多数酶的热失活服从式 d kd可称为一步失活常数或衰变常数 单位为 时间 1 kd的倒数称为时间常数td 当cEt为cE0的一半的时间称为半衰期 用t1 2表示 kd td和t1 2之间的关系为 2 多步失活模型 multi stepmodel A多半串联失活模型 酶的失活经历多步 即D F E B同步失活模型 全部酶分子可划分为热稳定性不同的若干个组分 每个组分均符合一步失活模型 该模型全部酶中残存酶活力的比率为 式中 cE0表示酶的初始浓度 xi表示失活速率常数为ki的酶组分的分率 因此 3 温度对酶失活的影响 对一级失活模型 有失活反应Arrihenius方程式中 kd表示衰变常数 Ad表示失活反应Arrihenius方程的前指因子 Ed表示失活反应活化能 一般蛋白质的变性或失活的活化能为125kJ mol 1 高于一般化学反应的活化能 20 83kJ mol 1 这意味着酶失活对温度十分敏感 同时考虑温度和时间对酶失活影响的关系式 二 反应时的酶热失活动力学 酶在反应中的稳定性称为操作稳定性 可通过分批测定 连续测定及圆二色谱分析等方法测定 作不同温度下反应转化率随时间的变化曲线 即反应过程曲线 如图2 1所示 图2 1不同温度下酶促反应过程曲线 a 以温度T为参数 转化率X与时间t的关系曲线 b 以时间t为参数 转化率X与温度T的关系曲线 2020 3 16 11 可编辑 由图 a 知时间一定时 随着温度的升高 反应速率增大 因而转化率增大 但当温度高到某一值时 其转化率反而减少 因为当温度升高到某一值时 酶的热失活速率也在加速 致使有活力酶的量在减少 因而反应速率下降 最终为零 由图 b 知 对于某一反应时间 存在一转化率最高的温度 该温度称为最佳温度 不同的反应时间 有不同的最佳温度 最佳温度是温度对酶催化速率和酶失活速率双重作用的结果 就底物浓度的变化对酶失活的影响 提出了下述模型 从上述机制看出 无论是游离酶 还是酶的复合物 均有可能失活 其失活速率方程可表示为 式中 表示底物对酶失活的影响系数 cEf表示游离酶浓度 根据上述模型可知 1 当 0时 反应时酶失活速率达到最低 从反应机制中可以看出 复合物ES完全不失活 或者说酶完全被底物所保护 2 当 1时 反应时与未反应时酶的失活速率完全相同 从反应机制中可以看出 复合物ES与游离酶E失活速率常数完全相同 或者说底物对酶失活没有影响 3 01时 反应时酶失活速率高于未反应时酶失活速率 从反应机制中可以看出 复合物ES失活速率常数大于游离酶E 或者说底物加速酶的失活 由上述分析可见 反映了底物对酶失活速率的影响 因此称 为底物对酶失活影响系数 也称为稳定性影响系数 若只有游离酶失活时 其分批反应的动力学方程为对于零级不可逆反应 cs值趋于无穷大 因此有 对该式积分 得到 当cs值足够大时 可简化为 进行积分得到 代入式中积分得式中 k2 kd 均为温度的函数 三 失活动力学研究实例 以青蟹N 乙酰氨基葡萄糖苷酶在甲醛溶液中的失活动力学的研究为例 通过在酶活力测定体系中加入不同浓度的甲醛 检测酶的剩余活力 2 2 研究显示酶在甲醛溶液中的失活作用是一种可逆过程 建立失活动力学模型 可以测定游离酶 E 和结合酶 ES 的微观失活速度常数 表d 图2 2酶在不同浓度甲醛中的失活作用动力学 a 动力学过程 b 半对数作图 0 4代表不同浓度的甲醛 表d青蟹N 乙酰氨基葡萄糖苷酶在甲醛溶液中的失活速度常数 从表d中可以看出 在相同浓度的甲醛溶液中 游离酶的正向微观失活速度常数 k 0 是酶底物络合物的失活速率常数 k 0 的3 5倍 表明游离酶比结合酶更容易失