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酵母双杂交系统技术介绍 March16 2020 宝日医生物技术 北京 有限公司 主要内容 March16 2020 2 酵母双杂交系统技术介绍 背景介绍 关注蛋白质 March16 2020 3 酵母双杂交系统技术介绍 背景介绍 为什么要研究蛋白互作 March16 2020 4 酵母双杂交系统技术介绍 背景介绍 Clontech酵母双系统的功能 March16 2020 5 酵母双杂交系统技术介绍 背景介绍 Clontech分子生物学工具 ClontechMatchmaker March16 2020 6 酵母双杂交系统技术介绍 背景介绍 MatchmakerGold系统 March16 2020 7 酵母双杂交系统技术介绍 背景介绍 MatchmakerGold系统原理 ReporterGene March16 2020 8 酵母双杂交系统技术介绍 ReporterGene ReporterGene 主要内容 March16 2020 9 酵母双杂交系统技术介绍 基本原理 酵母双杂交参考文献 Nature 1989Jul20 340 6230 245 6 Anovelgeneticsystemtodetectprotein proteininteractions FieldsS SongO DepartmentofMicrobiology StateUniversityofNewYorkatStonyBrook StonyBrook11794 28000次引用 March16 2020 10 酵母双杂交系统技术介绍 基本原理 GAL4转录因子的结构 AD DNA BD BD结合结构域 AD激活结构域 March16 2020 11 酵母双杂交系统技术介绍 基本原理 GAL4转录因子的分子机理 在GAL4based双杂交系统中 正常情况在酵母细胞内 Promoter galmetabolicgene GALUAS Transcription AD BD March16 2020 12 酵母双杂交系统技术介绍 ReporterGene GAL4AD 基本原理 三个启动子 四个报告基因 March16 2020 X a gal蓝白筛选 M1 G1 G2 降低假阳性 March16 2020 13 酵母双杂交系统技术介绍 主要内容 March16 2020 14 酵母双杂交系统技术介绍 Clontech酵母双杂交系统 MMSeries March16 2020 15 酵母双杂交系统技术介绍 ClontechMM系统的优点 SMART方法与同源重组技术结合构建文库 聪明的酵母自己做克隆 AbA抗性筛选的添加 有效抑制背景生长 大大降低假阳性 文库构建于型酵母菌株 型Y187中 方便后续与a型菌株Y2HGold进行mating直接筛选 March16 2020 16 酵母双杂交系统技术介绍 ClontechMM系统 蛋白互作基本流程 验证蛋白互作 自己构建文库 630490预制细菌文库 638802 传统型 预制酵母菌文库 630480 均一化 通用型 Clontech蛋白互作相关试剂盒 文库筛选 文库构建 酵母双杂交系统 630489酵母菌转化试剂盒 630439酵母培养基 套装 630495插入片段检测 630497酵母质粒提取 630467 体内验证 630489630305体外Co IP验证 630458630459631723631604 March16 2020 17 酵母双杂交系统技术介绍 文库构建 ClontechMM文库构建方法 SMART合成cDNA 共转化 涂板 培养 收集菌液 文库分装 冻存 1mlmating AAAAAAAAA TTTTTTTT CCC AAAAAAAAA TTTTTTTT GGG CCC AAAAAAAAA TTTTTTTT GGG LD PCR CCC AAAAAAAA TTTTTTTT GGG March16 2020 18 酵母双杂交系统技术介绍 SMART合成cDNA 共转化 涂板 培养 收集菌液 文库分装 冻存 1mlmating 聪明的酵母 自己做克隆 SD Leu Y187 同源重组 SMARTcDNA 两小时构建文库 March16 2020 19 酵母双杂交系统技术介绍 文库构建 ClontechMM文库构建方法 SMART合成cDNA 共转化 涂板 培养 收集菌液 文库分装 冻存 1mlmating SD Leu March16 2020 20 酵母双杂交系统技术介绍 文库构建 ClontechMM文库构建方法 文库构建 ClontechMM自制文库筛选 SMART合成cDNA 共转化 涂板 培养 收集菌液 文库分装 冻存 1mlmating Y187 AD文库 Y2HGold BD诱饵培养液 DDO X A 混合 QDO X A March16 2020 21 酵母双杂交系统技术介绍 文库筛选 ClontechMM文库筛选 630489Matchmaker GoldYeastTwo HybridSystem Y187Y2HGold 三个载体阳性对照 阴性对照 BDvector pGBKT7ADvector pGADT7 630439极大提高转化率可以单独购买 March16 2020 22 酵母双杂交系统技术介绍 文库筛选 ClontechMM系统质粒 March16 2020 23 酵母双杂交系统技术介绍 文库筛选 诱饵载体构建及其自激活检测 Y2HGold诱饵载体 March16 2020 24 酵母双杂交系统技术介绍 文库筛选 Mating方法筛选 Y187 型 DDO筛选 二倍体 Y2HGolda型 Mating接合反应酵母的有性生殖过程 Clontech利用这个过程 实现了文库筛选 AD BD MixMating QDO筛选 March16 2020 25 酵母双杂交系统技术介绍 文库筛选 均一化通用文库筛选 Y187 AD文库 Y2HGold BD诱饵培养液 DDO X A 混合 QDO X A March16 2020 26 酵母双杂交系统技术介绍 文库筛选 传统细菌文库筛选 取1ml菌液按照一定比例用LB稀释 150ul 板进行涂板 过夜培养 将提取的质粒转化Y187 获得酵母文库 将文库与诱饵培养液混合 进行Mating 涂筛选板 挑取阳性克隆子 刮取平板上的菌落 提取质粒 March16 2020 27 酵母双杂交系统技术介绍 文库筛选 验证阳性克隆子 PCR确认 25ul2 mix 30PCRcycles 25ulH2O 630497Matchmaker InsertCheckPCRMix2 March16 2020 28 酵母双杂交系统技术介绍 文库筛选 酵母质粒提取 630467EasyyeastPlasmidIsolationKit March16 2020 29 酵母双杂交系统技术介绍 验证互作 体内验证 SEAP 630305MammalianMatchmakerTwo HybridAssayKit2 March16 2020 30 酵母双杂交系统技术介绍 验证互作 体外Co IP验证 ProteinA GAgarosebeads MatchmakerChemiluminescentCo IPVectorSet 630458 MatchmakerChemiluminescentCo IPKit 630459 ProlabelChemiluminescentDetectionKit 631723 March16 2020 31 酵母双杂交系统技术介绍 验证互作 体外Co IP验证实验流程 PL检测 验证互作 FRET分析 632466pDsRed Monomer C1Vector 632470pAcGFP1 C1 Vector March16 2020 33 酵母双杂交系统技术介绍 ClontechMatchmaker系统产品选择指南 March16 2020 34 酵母双杂交系统技术介绍 TheFRIGIDAComplexActivatesTranscriptionofFLC aStrongFloweringRepressorinArabidopsis byRecruitingChromatinModificationFactorsKChoi JKim HJHwang SKim ThePlantCell 2011 AmSocPlantBiolExtracellularsignal regulatedkinase8 Erk8 controlsestrogen relatedreceptor ERR cellularlocalizationandinhibitsitstranscriptionalactivityMRossi DColecchia CIavarone AStrambi JournalofBiological 2011 ASBMBWSB 1 anovelIL 21receptorbindingmolecule enhancesthematurationofIL 21receptorHNara TOnoda MRahman AAraki Cellular 2011 ElsevierFHL1interactswithoestrogenreceptorsandregulatesbreastcancercellgrowthLDing CNiu YZheng ZXiong JournalofCellular 2011 WileyOnlineLibraryRab4interactswiththehumanP glycoproteinandmodulatesitssurfaceexpressioninmultidrugresistantK562cellsCFerr ndiz Huertas JournalofCancer 2011 WileyOnlineLibrary6 DuplicatedC classMADS boxgenesrevealdistinctrolesingynostemiumdevelopmentinCymbidiumensifolium Orchidaceae SYWang PFLee YILee YYHsiao PlantandCell 2011 JpnSocPlantPhysiolProteinInteractionDomainMappingofHumanKinetochoreProteinBlinkinRevealsaConsensusMotifforBindingofSpindleAssemblyCheckpointProteinsBub1andBubR1TKiyomitsu HMurakami MolecularandCellular 2011 AmSocMicrobiol ClontechMatchmaker系统近期参考文献 March16 2020 35 酵母双杂交系统技术介绍 主要内容 March16 2020 36 酵母双杂交系统技术介绍 常见问题分析 酵母双杂交文库如何获得 购买Clontech公司预制文库 用630490自己构建文库 请Takara公司提供文库构建服务 如何获得酵母双杂交文库 March16 2020 38 酵母双杂交系统技术介绍 常见问题分析 一定要做自激活检测吗 必须滴 自激活检测必须做 1 需要在Y2HGold菌株中进行 2 如果出现自激活现象需要调整AbA浓度或者调整序列 3 如果菌落生长过慢 可能是表达有毒性 需要用低拷贝质粒pGBT9 630490提供 March16 2020 39 酵母双杂交系统技术介绍 常见问题分析 诱饵的大小有限制吗 我们有文献报道的8 750个氨基酸都有成功的案例 Heery D M etal 1997 Nature387 6634 733 736 2 SchaeferB C Ed 1997 GeneCloningan