核酸荧光染色技术在血液分析仪.ppt

核酸荧光染色技术在血液分析仪的最新应用 希森美康医用电子 上海 有限公司 一 概述 技术 电阻抗 光散射 高频波 化学染色 及流式细胞术 目的 精确定量检测白细胞的五种亚型 1 五分类与三分类的主要区别 鞘流 CELLPACK CELLPACK 样本 半导体激光 激光波长 633nm 2 半导体激光 流式细胞 半导体激光 流式细胞 半导体激光 流式细胞 半导体激光提供的细胞信息 前向散射光 FSC 反映细胞大小 侧向散射光 SSC 反映细胞的内容物如核和颗粒 侧向荧光 SFL 反映细胞内DNA RNA的含量 3 高端机的作用 普通机对异常标本报警的灵敏度有限 常漏报 为了提高灵敏度 降低报警阈值 导致假阳性率升高 致力于高灵敏度地检测粒细胞的幼稚 异常成分 1 白细胞系统 2 红细胞 血小板系统 检测网织红细胞和有核红细胞 并能对网织红细胞的成熟度进一步分类 对于存在巨大血小板 血小板聚集 小红细胞或细胞碎片的样本 采用核酸染色加光学流式原理能准确检测血小板 二 核酸荧光染色加流式白细胞分类原理及临床应用 细胞浆的组成 核糖体 RNA占60 PRO占40 线粒体内质网高尔基体与中心粒微管微丝溶酶体 细胞核的组成 核膜 胞浆中内质网的延伸 核孔是核浆与胞浆交流及RNA进入胞浆的通道 核染色质 由DNA 组蛋白 非组蛋白组成 核仁 核仁丝与颗粒成分含RNA 核仁染色质含DNA 核浆 是细胞核体积随细胞成熟而变小的原因 细胞发育成熟的变化 细胞越幼稚 细胞核越大 细胞越幼稚 核染色质越疏松细致 核仁越明显 越幼稚细胞浆越少 瑞氏染色着色越深 表明浆内RNA含量越高 1 DIFF检测通道 检测参数LymphocytesMonocytesEosinophilsNeutrophils Basophilsother 溶解 WBCmembraneisweaklydamaged 染色RNADNA DIFF试剂作用示意图 Blast IG AbnormalLymph etc 高荧光信号 低荧光信号 高荧光信号 NormalCell 正常DIFF与BASO散点图 有核细胞在4DIFF散点图上的分布 4DIFF散点图 2 WBC Baso检测通道 检测参数WBCBasophil BASO试剂作用示意图 BASO otherWBC RBC Hemolysed Acid hypotonicsolution WBC BASO 散点图 SideScatter Internalstructure ForwardScatter Volume BASO WBC 成人T细胞白血病 ATL 与人类T淋巴细胞病毒 型 HTLV 相关的疾病 CD4 的细胞是HTLV 和HTLV 主要侵袭的细胞 是此类病毒的受体 其免疫表型 T细胞成熟标志 CD4 CD3 CD2 CD6 T细胞活化标志 CD25 IL 2受体 链 实例分析 外周血中可出现多形淋巴细胞 淋巴细胞大小不等 核染色质中等致密 核仁模糊不清 核明显不规则 呈多形性改变 扭曲 畸形或呈分叶状 核凹陷很深 呈二叶或多叶 或呈棒球状 手套状或折叠为花瓣状 故也称花细胞 形成原因 机体在某些因素的作用下 细胞的增殖紊乱 失去控制 由二极有丝分裂转变为三极或多极分裂 可有不对称的核分裂 分裂后形态奇异 ATL 大颗粒型淋巴细胞白血病 LGLL 正常人血象中的颗粒型淋巴细胞属大淋巴细胞 大部分为NK细胞 部分为T细胞 LGLL T LGLL与NK LGLL颗粒性原幼淋巴细胞胞浆在瑞氏染色中常染成蓝色 胞浆中出现5 15粒清晰的粗大的颗粒 诊断标准 骨髓中颗粒性原幼淋巴细胞应 5 一般 10 LGLL N T ALL N T ALL通常为B淋巴细胞系统白血病 极少为起源于淋巴干细胞或性质不明 分型 型 无标志型 型 普通型 型 前B细胞型 型 B细胞型主要表型标志 HLA DR CD19 CD20 CD10的表达不同 B ALL CML急变 AML M2 AML M3 AML M4 M5b 三 核酸荧光染色检测网织红细胞参数原理及临床应用 RET检测通道检测参数 RETIRFLFRMFRHFRPLT O RET试剂作用示意图 染色 Ploymethine RNAOxazine DNA RET WBC RBC 高荧光信号 很低荧光信号 非常强的荧光信号 Fluorescence RNA RET散点图 IRF IRF 网织红细胞散点图 IRF是评价肿瘤化疗后骨髓造血功能受抑和开始恢复的较敏感的指标 较RET 达到正常参考范围低限要早14天 网织红细胞参数检测的临床意义 Mugurama应用R 1000对27例白血病和淋巴瘤病人 在化疗期间作了网红各参数的系统观察 发现有14例在化疗开始时 HFR MFR的降低早于中性粒细胞和血小板 有37 2 的病例HFR MFR与其它参数同时降低 在骨髓恢复时 52 8 的病例HFR或MFR迅速升高 HFR MFR与WBC PLT同时升高的仅占25 Kageoka等利用SysmesR 1000分析了骨髓和外周血中网红与造血状态的关系 发现外周血网红计数用于分析骨髓造血状态优于白细胞计数和血小板计数 化疗后骨髓造血功能从抑制到恢复时 末梢血中HFR的增高较WBC的增加早数天 外周血造血干细胞移植后病人的IRF 升高提示有较多未成熟细胞从骨髓进入外周血 表明该病人骨髓的造血功能已开始恢复 从我们观察的病例可以看出 移植后IRF在一定时间内可以出现并升高 则病人死亡率为零 因此我们认为IRF的变化较网织红细胞总数变化具有更重要意义 IRF 的变化可作为评价肿瘤病人化疗或外周血干细胞移植过程中骨髓造血功能受抑和开始恢复的较敏感指标 四 核酸荧光染色加流式检测有核红细胞原理及临床应用 NRBC试剂作用示意图 WBC NRBC RBC 高荧光信号体积 大 低荧光信号体积 小 弱荧光信号体积 很小 溶血 WBCmembraneisweaklydamaged 染色RNADNA NRBC散点图 ForwardScatter Volume RBCGhost NRBC WBC Fluorescence NRBC散点图 NRBC散点图 WBC区域 NRBC区域 红细胞碎片 低值CV为3 42 中值CV为1 64 高值CV为1 39 该精密度水平超过了NCCL对血液分析仪进行细胞计数的精密度要求 3 检测NRBC的高精密度 2 NRBC 原理 2 有核红警号 NRBC 性能评价 检测灵敏度为94 3 检测特异性为97 8 阳性预期值为76 7 阴性预期值为99 6 检测总有效率为97 6 2020 3 16 50 可编辑 警号 NRBC 假阳性率为23 3 其可能的原因有 XE 2100每个NRBC测试需分析10 000个以上的有核细胞 而血涂片法仅检测200个有核细胞 血液标本中可能存在死亡的小淋巴细胞 其体积及荧光强度与NRBC的裸核相近 警号 NRBC 假阴性率为0 44 其可能原因为 漏检测的NRBC均为嗜碱性NRBC 其胞浆着色偏蓝 表明该细胞浆内核酸含量较高 因此在白细胞分类散点图上可能出现在淋巴细胞区域 有核红细胞检测的临床意义 NRBC只有在异常情况下才会出现在外周血循环中非正常生理情况 早产儿 强烈促红细胞生成素刺激造血功能严重不全以及组织缺氧状态确保白细胞计数的准确 五 核酸荧光染色加流式检测血小板的原理及临床应用 光学法血小板检测原理 在激光流式通道内 663nm波长的激光照射细胞 用流式细胞方法绘出前向散射光 FSC 和侧向荧光 SFL 在血小板散点图 血小板体积较红细胞小 分布在红细胞下方 血小板内含极少量的核酸 侧向荧光的强度较成熟红细胞稍大 PLT O散点图 PLT O PLT O SysmexXE 2100阻抗法 光学法计数血小板与红细胞 血小板比率法的比较研究 引言 准确计数血小板在血小板减少性疾病的诊断和治疗过程中非常重要 SysmexXE 2100血液分析仪 阻抗法 血小板 PLT I 光学法 血小板 PLT O 国际血液学标准化委员会 ICSH 和国际实验血液学委员会 ISLH 推荐方法 红细胞 血小板比率法 血小板 PLT R 实验仪器与原理 一 血液分析仪 SysmexXE 2100全自动血液分析仪 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 CumulativeSizeDistributionCurve PulsePicture 10 20 30 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 4 1 0 0 0 1 2 3 4 5 4 3 2 1 1 电阻抗法原理 Histogram 2 报警信号的类型及含义 类型含义检测通道AbnDst血小板分布异常血小板PLTClumps血小板聚集白细胞分类网织红细胞PLTClumps S 血小板聚集血小板 PLT I Report PLT O 3 PLT I和PLT O转换规则 二 流式细胞仪 美国BD公司生产的FACS Calibur流式细胞仪 1 试剂 pH7 4PBS缓冲液藻红蛋白标记的单克隆抗体 CD41 PE 异硫氰酸荧光素标记的单克隆抗体 CD61 FITC 2 红细胞 血小板比率法原理 PLT R RBC I RBC PLT 106 L 以FCS SSC设门以CD61 CD41设门以CD61 CD41对R1设门 RBC LPLT PLT RBC LPLT LPLT 实验方法 1 XE 2100样本检测 用CBC DIF RET模式进行血常规检测 实验参数 1 RBC I2 PLT I3 PLT O 1 10 lPBS加于Faclon管2 5 lCD41 PE3 5 lCD61 FITC4 1 lEDTAK2抗凝全血5 混匀后放于20 25 暗箱孵育15分钟6 500 lpH7 4PBS7 计算出RBC PLT R 2 FCM检测 3 批内精密度试验 取无血小板报警信号的三份新鲜全血样本 血小板数分别在低值 正常值和高值范围 分别用三种方法连续测试11次 4 相关性试验 A组 20例 noflagB组 20例 PLTClumps或PLTClumps S AbnDstC组 11例 AbnDst A组 noflag B组 PLTClumps AbnDst C组 AbnDst 结果 1 精密度试验 批内精密度 n 8 参数低值正常值高值 109 L XSDCVXSDCVXSDCVPLT I 861 772 061512 881 994844 600 95PLT O 902 442 711443 932 734456 191 38PLT R 901 872 081482 611 764564 220 93 2 相关性试验 表3 各光学法与比率法相关性试验结果组别钭率截距R2PA组1 031512 9570 9846P 0 001B组1 193914 1850 9011P 0 001C组1 0056 0 78430 9934P 0 001表4 各组阻抗法与比率法相关性试验结果组别钭率截距R2PA组1 07745 11410 9093P 0 001B组1 032212 5470 9599P 0 001C组0 78219 0150 1542P 0 05 A组 B组 C组 讨论 由于血小板体积小 无色 易粘附 易聚集 因此要准确计数外周血中的血小板确非易事 从我们的研究结果可以看出 无警号组阻抗法与比率法 光学法与比率法间均有很好的相关性 P 0 001 1 无警号组 利用阻抗法原理计数血小板的血液分析仪 对于形态正常的血液标本 结果比较可靠 而光学法计数血小板的批内精密度要低于阻抗法与比率法 这与文献报道一致 从我们的研究结果可以看出 出现血小板聚集警号的样本组 两方法与参考方法间也有显著相关性 2 出现血小板聚集警号组 原因 1 采用浮动界标技术 2 6fl与12 30fl间设置浮动辨别线 LD 和 UD 2 可能与统计样本总体血小板数较高有关 外周血涂片中可见血小板聚集 3 仅出现AbnDst警号组 我们选择了仅出现血小板直方图异常警号的12例样本 其血小板数均低于60 109 L 其血小板直方图显示有较多的巨大血小板存在 其中11例为特发性血小板减少性紫癜病人 1例为巨大血小板综合症病人 光学法与比率法间有显著相关 而阻抗法与比率法间无相关性 ITP病人外周血涂片中可见巨大血小板 原因 仪器将在2fL至30fL范围内的颗粒定义为血小板 因此当血小板颗粒大于30fL时 仪器就将其归为红细胞 PLT O 用流式细胞仪计数血小板时 仅用CD 41单抗或CD 61单抗 血小板数有差异的占73 8 48 65 因此ICSH ISLH推荐的方法为两者同时使用 在检测过程中 我们认为有两点需要特别重视 样本检测时 荧光抗体的量必须合适 如果荧光抗体的量过剩 则容易与其他微粒结合或形成免疫复合物 如果样本中存在较多的白细胞碎片 会对血小板计数造成干