光学成像技术在医学中的应用.doc

*大学毕业论文本科毕业论文 题 目：光学成像技术在医学中的应用 院 （部）：理学院专 业：应用物理学班 级：光电111姓 名：学 号：22345678指导教师： 完成日期: 2012年6月2日V目 录摘 要ABSTRACT1 前 言1.1 医学成像技术简述11.2 光学成像对医学发展的意义22 OCT成像技术在医学中的应用2.1 光学相干层析成像技术(OCT) 简介42.2 OCT成像技术原理4 2.2.1 OCT成像技术基本原理4 2.2.2 后向反射光相干层析成像5 2.2.3透射光相干层析成像72.3 OCT成像技术在眼科中的应用82.4 OCT成像技术在皮肤病中的应用92.5 OCT成像技术在心血管类疾病中的应用92.6 OCT成像技术在消化系统疾病中的应用102.7 OCT成像技术中医学中的应用112.8 OCT成像技术应用前景113 荧光成像在医学中的应用3.1 荧光成像在生物学领域应用中的独特优势133.2 荧光成像的原理与方法133.3 荧光成像技术在药物新剂型的应用183.4 荧光成像在癌症检测中的应用19 3.4.1膀胱癌19 3.4.2脑部肿瘤20 3.4.3 卵巢癌21 3.4.4 皮肤癌21 3.4.5 口腔癌223.5基于在体荧光成像技术的中药抗肿瘤研究22 3.5.1在体荧光成像是肿瘤可视化实验的重要基础24 3.5.2肿瘤在体荧光成像的应用及特点24 3.5.3肿瘤的在体荧光成像在中医药研究中的应用243.6 荧光成像技术的发展前景264 新显微成像技术4.1 新显微成像技术简介274.2 新显微技术的优点274.3 新兴的显微成像技术28 4.3.1超分辨显微技术28 4.3.2 活体显微术和深层组织成像30 4.3.3 纤维光学成像IVM 31 4.3.4 高通量显微方法和图像处理33 4.4 新显微成像技术发展前景345 结 论谢 辞37参考文献38大学毕业论文摘 要医学成像技术在现代医学中的作用越来越明显，越来越重要。本文主要通过目前应用于医学领域的光学成像技术：光学相干层析成像技术(optical coherenee tmographv简称 OCT)、荧光成像技术、显微成像技术等来对现代医学中所实际应用的光学成像技术进行详细的说明，包括OCT成像技术在眼科、心血管疾病、皮肤病、消化系统疾病、中医学等中的应用，荧光成像技术在药物新剂型、癌症、中药抗肿瘤等中的应用以及新显微成像技术在医学中的应用。光学成像技术在疾病观察，治疗，以及药物的研发等方面凭借其特有的优点已经表现出巨大的优势，本文通过对在医学领域中，光学成像技术的具体应用的研究，来发现其未来的发展前景与方向。关键词：光学成像技术；光学相干层析成像技术；荧光成像技术；新显微成像技术IVThe Application of Aptical Imaging Technology in MedicineABSTRACTThe role of medical imaging technology in modern medicine is more and more obvious, more and more important. This paper mainly through the application in the medical field of optical imaging technology: the technology of optical coherence tomography (Referred to as OCT), fluorescence imaging, microscopic imaging technology to practical application in modern medicine such as optical imaging technology in detail, including the OCT imaging technology in ophthalmology, cardiovascular disease, skin disease, digestive system diseases, such as traditional Chinese medicine, the application of fluorescence imaging in new drug formulations, cancer, and the application of traditional Chinese medicine such as antitumor and new microscopic imaging technology in the medical application. Optical imaging techniques in the observation of disease, treatment, and drug research and development, with its unique advantage has shown great advantages, this article through to in the medical field, the concrete application of optical imaging technology research, to discover its development prospect and direction of the future. Key Words: optical imaging technology；optical coherence tomography；fluorescence imaging；microscopic imagingV1 前 言1.1 医学成像技术简述生物医学工作者一直在寻找理想的，无创性生物体检测方法，以求安全、及时、有效的发现疾病，并对其进行区分、定位。用光学方法实现这一目的一直是人们梦寐以求的。189年伦琴发现了X射线(X-ray)，这是19世纪医学诊断学上最伟大的发现。X-ray透视和摄影技术作为最早的医学影像技术，直到今天还是使用最普遍且有相当大的临床诊断价值的一种医学诊断方法。X线成像系统检测的信号是穿透组织后的X线强度，反映人体不同组织对X线吸收系数的差别，即组织厚度及密度的差异；图像所显示的是组织、器官和病变部位的形状。核医学成像系统又称放射性核素成像(RNI)系统，所检测信号是摄人体内的放射性核素所放出的射线，图像信号反映放射性核素的浓度分布，显示形态学信息和功能信息。核医学成像与其他影像学成像具有本质的区别，其影像取决于脏器或组织的血流、细胞功能、细胞数量、代谢活性和排泄引流情况等因素，而不是组织的密度变化。它是一种功能性影像，影像的清晰度主要取决于脏器或组织的功能状态，由于病变过程中功能代谢的变化往往发生在形态学改变之前，故核医学成像也被认为是最具有早期诊断价值的检查手段之一。超声成像系统的检测信号是超声回波，图像信号反映人体组织声学特性的不同，从而显示甚至动态显示器官的大小和形状。超声成像设备主要应用超声波良好的指向性和其反射、折射、衰减规律及多普勒效应等物理特性，采用各种扫查方法，将给定频率的超声波导入体内，超声波遇到不同组织或器官界面时，将发生不同程度的反射和透射，接收携带信息的回声，利用不同的物理参数，将信号经处理后，显示为波形、曲线或图像，观察分析这个结果，结合临床表现可对疾病做出诊断。核磁共振(MRI)成像系统检测的信号是生物组织中的原子核所发出的磁共振信号。原子核在外加磁场的作用下接受特定射频脉冲时会发生共振现象，MRI系统通过接收共振信号并经计算机重建图像，用图像反映人体组织中质子状态的差异，从而显示体层内的组织形态和生理、生化信息，系统通过调整梯度磁场的方向和方式，可直接获得横、冠、矢状断面等不同体位的体层图像。然而，这些已有的无创性探测方法却有如下的局限性：X射线成像或其他方法对早期肿瘤无法进行精确的探测，无法区分良性与恶性肿瘤。用X射线经常做常规检查可能对组织产生电离，形成潜在的伤害。若用光学成像方法，即使做长时间探测，也不会对生物组织形成伤害，并可以对早期肿瘤进行探测并判断其性质。放射性同位素的应用有限，身体接触会形成长久伤害。超声波对线性尺寸小于几毫米的物体的分辨率较差，超声Doppler仪分辨率也只有几百毫米，且不可能知道组织的化学成分，而利用光学成像方法分辨率可达到小于100毫米。核磁共振(MRI)可达到次毫米级空间分辨率并可探测特殊化学物质，但探测不到特殊元素，如氧元素，而氧元素是生物组织中的关键元素。与X射线和超声波成像不同，只有光提供了机体化学物质光谱探测的可能性。由于MRI应用时需要超导磁，所以MRI使用成本很高。1.2 光学成像对医学发展的意义由前面分析可以看出，生物组织中物体的光学成像有其独特优点，目前随着光源的改善，技术的改进（成像方法，记录方法等），生物组织的光学成像成为可能，它作为光诊断方法在生物医学领域将具有潜在的、广阔的应用前景。其实早在维多利亚时代的医生就用过以烛光探测胸部肿块的无效尝试，但随着光源强度的增 加、检测微弱光信号技术、计算机重建图像技术的成熟，光学生物成像技术现在可以成功地完成区分、定位、诊断生物内部组织。因为光在组织中穿行被吸收和散射时，人射光的强度、相干性以及偏振情况将发生改变，这些特性的变化程度取决于光的波长、组织的类型和厚度。光的吸收是由于组织内部原子和分子不同能级间的电子跃迁产生的。光的散射是由于组织中微观和宏观结构折射率的改变造成的。因而从介质出射的光与入射光相比，具有许多特性改变，这种特性的改变包含了大量的组织内部结构和成分的信息，也就是说不同生物介质具有独特的光谱特性。提取这部分信息可以获得组织表面清晰的结构图，医生根据此来区别不同的组织，准确地查出存在隐隐患的部位及恶性发作的危险性。生物组织中的光学成像研究在90年代初提出，一经提出在国际上引起广泛关注，国外研究者已在此方面做了许多基础研究工作，而国内在这方面的研究却很少。现有极少数研究单位从事生物体内物体的光探测，得到相关信息。真正能够对生物组织中物体进行光学成像研究的国内还很少。2 OCT成像技术在医学中的应用2.1 光学相干层析成像技术（OCT) 简介光学相干层析成像系统是基于低相干光的干涉特性，在十涉仪中，一束光分为两部分，经过不同的路径后再结合只有当这两束光相干( 即相位差保持恒定）时才能形成干涉条纹。常见的光学相干层析成像仪有2种，一种为采用后向反射光相干的光纤迈克尔(Michelson)干涉仪 系统，另一种是采用透射光相干的马赫一泽德( MachZehnder) 干涉仪。2.2 OCT成像技术原理2.2.1 OCT成像技术基本原理图2.1 oct的基本装置光路图OCT的基本装置如图l所示，其核心部分是一个垒光纤Michelson干涉仪，以SLD为光源，通过50/50光纤耦合器，反射光形成的干涉信号由检测器接收后检渡器从中取出信号，模数转换后存入计算机。考虑光源的时间相干性，采用复相干函数描述 ： (2.1)则光源的相干长度为 (2.2)因此,如图用Micheison干涉仪做实验时，检测器接收到的电流为： (2.3)当光源的相干长度很短时是从样品内部不同的面上反射的，具有不同的光程，假设可用如下形式描述：，表示第i个反射面上反射的光,而，因此只有当某个时，信号才有可能被提取出来，即获得了第k个反射面的信息。当不断改变时就可以获得整个样品的内部信息。由于光源具有一定的相干长度，反射光的信息可以看k是相干长度内的平均值，其空间分辨率为相干长度的量级，影响分辨率的不仅是光源的线宽，还与光源的线型、检测器性能等有关。对于Gauss线型光源，其纵向分辨率可为： (2.4)其中为光源的中心波长，为光谱的半高全宽(FWHM）。OCT成像的横向分辨率则取决于样品入射光束在相应反射面上的光斑大小一般在10m左右。2.2.2 后向反射光相干层析成像图2为David.Huang等人在 1991年研制的OCT扫描成像设备，原理相当于迈克尔干涉仪，它以超发光二极管(SLD)作为光源，采用光纤代替普通的空间光路，这样一方面可以减少干涉仪光路安装和调整的困难，并且能使仪器结构小型化、简单化，另一方面可以通过简单的采用在被侧环境中增加传感光纤的长度来提高相位调制对环境系数的灵敏度，从而使干涉测量技术从实验室走向更多场合的应用。光经过光纤耦合器分为两束进入干涉仪的采样臂和参考臂的光纤，光在采样臂上样品的后方散射和照射到参考反射镜的反射光合成干涉后把相位调制信息解调成幅度变化。来自样品的光相干特性信息提供 了光的反射处边界和后向散射的地点。当OCT系统采样臂执行一个多点纵向扫描时便会提供样品的一个二维横向图像，这种操作方式类似于 B 超的成像方式，经AD转换采集和处理后由计算机分析得到一幅组织断面上的二维图像。图2.2 光纤后射反射光相干成像系统示意图由于低相干的原因，如果采样臂和参考臂的光不匹配时，光信号衰变得很快，因而探测到的信号很微弱，这样对于样品的反射信号来说可以有着很高分辨率。OCT系统的纵向分辨率仅由光源的相干长 度所限制，这样OCT即使在人射光孔很小的情况下，仍可保持较高的深度分辨率。这个特性在对体内深层组织的测量时特别有用。为了获得二维影像的数据，在一系列高速、连续运动进行纵向扫描时，光束要在扫描之间做侧向移动。图像的侧向分辨率由光束在样品中的直径所限制。在样品中光反射边缘的测量在周围没有强反射的情况下，定位的精度可以控制在2m以内。由于OCT图像只是确定样品中某一兴趣点的深度和横向位置，可以看作为一个灰度或伪彩影像(暖色彩代表高反射区域，冷色彩代表低反射或不反射区域)，这样它在图像重建时所需的计算量比X线CT和MRI少的多。 OCT对反射光信号有着极高的灵敏度，对于仅20W的人射光功率，系统可以以10fw的灵敏度探测到的入射强度，这样的高灵敏度由光外差探测得到，光外差探测信号比直接探测高78个数量级，光外差探测器输出的中频功率正比于信号和本振光平均功率的乘积；而直接探测器的输出正比于信号的平均功率，当光信号功率很少时就不能检测到。而光外差检测器，尽管在信号光功率非常少，只要本振光功率足够大，仍能得到可观的功率输出，同时光外差技术抑制噪声，大大提高了信号的信噪比。光干涉信号被多普勒移相和正弦压电调制在一个很高的频率 上。参考反射镜被固定在一步进电机上以1.6 mm/s的运动作纵向扫描，同时电产生一个3.8 kHz多普勒频移，使信号光和参考光束之间形成差频干涉，从而避开探测器的低频噪声带，通过电子技术处理使光源噪声只改变信噪比，而不影响干涉输出数据。采集臂的光纤在压电传感器作用下，给采样光信号提供21.2kHz正弦相位调制，使相干光束间的相位差作周期性变化，从而形成正弦波相位调制。在一系列纵向扫描后进行删向光束位置移动，完成信号的整个采集过程。当 2路符合干涉条件光信号被探测器输入后，以25kHz的解调复原干涉信号幅度输出。这样通过调制和解调后加一特定带宽滤波器处理，可大大去除其他噪声的干扰，同时由于光外差检测方法对光强渡动和低噪声不敏感，可提高整个系统的信噪比(94db)。最后经A/D转换存储在计算机中，进行图像重建处理形成二维图像。成像图像的时间由纵向扫描速度所决定。如：以1.6 mm/s的扫描速度，在2mm深度做150个点的纵向扫描，最低的成像时间为190s。同时成像时间也受系统探测灵敏度和信号带宽折中考虑而影响。如果入射光功率(ANSI允许眼部最大安全曝照剂量)200W，以光学摄影的信噪比条件下，OCT成像时间仅为200ms，当然在更小部位和粗糙的图像情况下可以更快。在非眼部的OCT成像中，由于允许入射光的功率可以加大，成像时间故而较短。2.2.3 透射光相干层析成像原理上透射相干光成像系统类似于反射系统（图3）。是美国Michael.R.Heel等人1993年发表的研究成果。用80MHz的锁模Ti： Al2O2激光器产生波长为830nm的超短光脉冲(50400fs)，并耦合到纤维光学马赫泽德干涉仪中，使参考延迟反射镜后向反射的光与通过样品的透射光汇合，观测其干涉现象。比较迈克尔干涉仪其优点在于：可以避免干涉光路中的光再反射回光源，降低对光源的影响，有利于降低光源的不稳定噪声，并且可以获得双路互补干涉输出，便于信号接收和处理。这个系统能探测到入射光功率为4.5l0-10mW的相干透射光、参考光束与样品出射的信号光束干涉产生外差增益。压电纤维扩展器相位调制干涉信号为10kHz,并应用锁定探测器滤掉1/f的机械噪声。双平衡器用于消除激光随机强度涨落并实现量子发射探测噪声极限探测。本系统局限在一些样品的检测，不能用于人体体内的实时检查。图2.3 光纤透射光相干成像系统示意图2.3 OCT成像技术在眼科中的应用OCT技术的第一个临床应用领域就是眼科学。传统的诊断方法由于不能探测到眼底组织的细微变化，通常眼底病病情严重时方能明确诊断。OCT可对一些眼科疾病进行早期诊断。OCT技术主要测定视神经纤维的厚度、测量视网膜结构、拍摄黄斑疾病、诊断和检测视网膜疾病等，因此可以检测诸如青光眼、糖尿病性黄斑水肿等需要定量测试视网膜变化的疾病。OCT诊断各种视网膜疾病非常有用，从有斑点产生，到青光眼形成，再到视网膜脱离均可探测，在眼科临床检测方面得到广泛的应用。对于青光眼的诊断和处理，传统的诊断方法由于不能直接扩瞳观察视网膜，临床上对此类疾病的诊治比较棘手。眼内压测量只有在病变后期视网膜神经纤维缺少50以上时，才能检测到视野缺损和视神经乳头凹陷，因而不利于疾病的早期诊治。OCT拥有很高的成像分辨率，无须使用阿托品扩瞳，是这类疾病检查的可行工具。相对于玻璃体和视网膜结构，视网膜神经纤维层(retinal nerve fiber layer，RNFL) 是一个相对高散射的介质层，由于视网膜神经纤维的独特结构，RNFL的后向散射信号强度依赖于入射光的角度，这种依赖性导致了RNFL信号的衰减。OCT可以及时了解RNFL厚度的变化，进而估测青光眼病情。Tsai应用OCT对具有正常视野的急性原发性闭角型青光眼患者发作后RNFL厚度和正常眼RNFL厚度进行对比，发现青光眼发作时1/4 RNFL厚度较正常对照组和另侧眼组有显著的差别，具有正常视野的急性原发性闭角型青光眼患者发作后RNFL厚度显著减小，据此提出OCT测量的RNFL厚度与视神经功能密切相关，可作为区别青光眼和正常眼的手段之一。我国台湾学者Chen等 应用OCT定量测定早期伴有视野缺损的原发性开角型青光眼患者和正常人RNFL的厚度，并分析RNFL的厚度与伴有视野缺损的早期青光眼的相关性，发现在两组中RNFL的厚度明显不同，据此提出通过 OCT测量RNFL的厚度有助于早期青光眼的诊断。2.4 OCT成像技术在皮肤病中的应用临床上皮肤病能够引起皮肤组织结构的病变，如炎症、角质层的角化过度、角化不全和坏死等均可引起皮肤组织微观结构的改变。皮肤组织病理学的检查，以往需要取活体组织，除了引发医源性感染外，对痛感神经分布发达的皮肤及黏膜活检时可给患者带来了明显的疼痛。OCT具有高分辨率、非侵入性、操作简便、费用低廉等优点，因此可能成为皮肤病临床诊断的有效工具，也为皮肤病研究人员提供新的研究手段。OCT可观察到表皮和真皮的超微结构，可起到类似活体组织病理学观察的作用，可用于诊断皮肤疾病。例如，利用高分辨率的OCT能检测到人体健康皮肤的表皮层、真皮层、附属器和血管；波长为830nm的光源，将甘油和丙二醇涂于小鼠皮肤表面OCT成像，可见表皮、表皮基底层、真皮乳头层、真皮网状层、皮下组织、 筋膜、肌肉和毛囊。Welzel等用各种外部刺激引导正常皮肤形态和功能的改变，并成功地应用OCT检测了其中角质层厚度的改变和由黑素、水肿和红斑导致的改变，表明不同的生理状况将影响皮肤的光学特性。Yeh等用OCT、多光子显微镜镜(multiphoton microscope，MPM)在皮肤组织仿真模型中检测激光热损伤和随后的损伤修复。welzel等用OCT鉴别表皮层和真皮层疱疹的定位、恶性黑色素瘤诊断、手湿疹成像、疥螨和螨下面皮肤的孔成像等。Zhong HQ等利用OCT对实验性大鼠皮肤损伤进行成像研究，表明有很好的效果。OCT还可用于接触性皮炎和牛皮癣的检测。2.5 OCT成像技术在心血管类疾病中的应用OCT对冠状动脉硬化、心肌梗死等血管性疾病诊断有独特的优势。以往的成像技术无法迅速而明确地得到心血管粥样硬化、栓塞、心肌缺血坏死等病情。在冠状动脉OCT成像中，由于该系统的分辨率和灵敏度都很高，冠状动脉组织有较大的后向散射和脂肪钙化斑状的阴影效应，使脂肪钙化斑状层、纤维动脉粥样化和正常动脉壁对比十分明显。Jang等研制出基于导管系统的冠状动脉内OCT成像系统并将这种技术首次用于人类，结果表明OCT比血管内超声(intravascular ultrasound，wus)更加优越，分辨率更高(10m-100m)， OCT除了能检测出大多数IVUS检测出的结构特征，还提供更详细的结构信息。OCT可以检测到断裂的内膜、腔内血栓、球囊造成的夹层的深度、切割球囊的切口、组织脱垂和未展开的支柱和内膜增生。这种新成像技术可能在改善冠状动脉介入效果和识别易损斑块方面发挥重要作用。在活体蛙心脏跳动的OCT图像中，可观察到与心脏结构和功能有关的定性、定量信息，如节拍律、室壁位置、心脏收缩和舒张期间心室容积等。美国加利福尼亚大学的Chen等，将OCT成像与多普勒技术相结合，组成一种新的检测仪器光学多普勒层析系统(optical Doppler tomography，ODT)，这种系统可以用来检测高散射介质中的流体速度，如皮肤表层的血流速度，可用于确定亚表层中微血管直径和血流速度分布等，对疾病的诊断很有帮助。OCT成像的管状化和内镜式活检可以帮助医师充分了解病变的部位、范围、程度和类型等信息，对心血管疾病的诊断、治疗和疗效提供参考依据。2.6 OCT成像技术在消化系统疾病中的应用以往胃肠道病变(如早期的胃炎、胃癌、十二指肠溃疡和胰腺癌等)的早期诊断一直困扰着医学界。常规活检容易造成局部感染，运用OCT可以避免活检对人体的伤害，而且对组织的微观结构的成像质量接近或达到组织病理学水平，使医生能更加直观地了解组织微观结构的变化，并为疾病的诊治提供科学的参考依据。对于肿瘤侵犯血管等难以活检或活检不可到达部位的病变，OCT成像能够以近似无创的方式进行观察。同时在一些必须活检的部位，OCT可以作为导航工具，引导临床医生选择最佳的活检部位，这样降低了活检过程中的并发症，并能提高活检的成功及阳性率。钟会清等利用OCT技术动态观察溃疡的愈合过程，为动态、在体研究溃疡的愈合质量提供了有益的尝试。Evans等和Bouma等采用与病理对照的方法研究食管的 OCT图像特征及对Barrett食管的诊断意义。结果显示，OCT能清楚地区分正常人食管上皮及肌层，对Barrett食管的诊断敏感性和特异性分别为83和75，认为 OCT是对内镜一个有益的补充。Sivak等将直径2.4 mm的圆型OCT探针通过内镜插入，得到360度的横向扫描图片，变换探头和黏膜表面的距离产生了不同深度的胃肠壁的图像。在活体胃肠组织的OCT图像中，隐窝腔、上皮细胞和固有层之间的后向散射振幅之间的差异清楚，黏膜和黏膜下层清晰可见。2.7 OCT成像技术中医学中的应用由于OCT系统比超声波成像、C T、核磁共振和正电子发射层析成像技术等具有独特的优点，可用于中医学方面的临床研究。人体各器官的信息在一些眼、耳、舌面、手腕桡动脉等部位都会有集中的反映，中医对这些区域进行望闻问切就成为诊断病情的依据。其中舌苔面积大，其颜色、形态变化比较明显，直观性强，历来是中医诊病时观察主要区域之一。但对舌苔形状、厚薄的分辨却一直是凭医师的经验，伸缩性大，不能对此有定量分析。曾常春等和Zhong HQ等将 OCT应用于中医舌诊中，对大鼠的舌苔及舌苔下浅表舌体组织进行显微成像观察，结果显示此方法能够实现舌体深层组织的显微成像。可观察到三层基本结构：表面舌苔层、舌表面上皮细胞层与舌体组织层；OCT的在体显微扫描也可见三层组织结构：舌苔分布层、舌苔与舌体的紧密连接分界层、舌体组织结构层；通过测量发现，OCT与常规组织切片光镜下显示的舌组织外两层结构具有一定的相似性。另外，对OCT在体显微成像后图像的分析，可以实现将舌苔苔质的厚薄、润燥、腐腻和有根无根的量化性研究，对剥落、消长等变化方面可进行客观的评价，并对脾胃湿热证大鼠舌苔的厚度与舌体的津液量进行了量化性分析。2.8 OCT成像技术应用前景OCT成像避免了x射线、强磁场、超声波等辐射对人体造成的潜在危害提供了安全的监测手段。另外，OCT能进行活体快速层析成像，对于以往医疗诊断中难以观察的、又不适宜作切片检查的组织，将可以通过OCT进行成像，从而避免检测时对组织的损伤，同时又能获得较高的空间分辨。OCT的成像分辨率比传统的成像技术的分辨率高得多(微米量级)，可以用于诊断一些传统的诊断方法很难胜任的疾病，且可实时检测OCT技术由于它的独特优点，故具有非常重大的临床应用价值和广阔的市场前景。近十几年，OC T技术发展变化非 常迅速，基于OCT的新型检测设备层出不穷，应用范围日益扩大，尤其是它与传统的医学设备及诊断手段相互结合，相互补充，在生物医学检测和疾病诊断上将具有不可估量的优势及诱人的应用前景。3 荧光成像在医学中的应用3.1 荧光成像在生物学领域应用中的独特优势高灵敏度：灵敏度进超比色法，在大部分应用中其灵敏度近乎放射性同素。 多组样品一次成像：将不同样品（如：对照、处理）通过不同发射波长的荧光素标记（如Cy3或Cy5等可以同时检测多样品荧光信号。 稳定性高：较放射性同位素相比，荧光素标记的抗体、杂交探针、PCR 引物等的信号稳定性优势明显，可稳定存在数月以上，这使需要大规模标记并多阵列之间的标准化比较成为了可能。 低毒性成本低：多数情况下，荧光标记和检测的全过程试验用手套即可对实验者提供足够的保护。易于运输和实验后处理，多数情况下实验成本低于放射性同位素。 商业可获得性：许多重要的荧光标记型生物大分子如各种单抗、多抗、CAT等及荧光标记用试剂盒都可以方便获得,同时一些公司提供荧光标记的外包服务。3.2 荧光成像的原理与方法(1) 荧光信号的产生及信号捕获原理：荧光物质被特定外界能量激发（如激光等高能射线），引起其电子轨道向高能轨道跃迁，并释放能量回归基态的过程中会产生可被检测的荧光信号。当然不是所有的物质都能被激发产生荧光，只有当该物质与激发光具有相同的频率并在吸收该能量后具有高的荧光效率而非将能量消耗于分子间碰撞过程中，其荧光信号才可被光学设备所检测（图3.1）。（2）荧光成像系统的组件和工作原理：荧光物质被激发后所发射的荧光信号的强度在一定范围内是与荧光素存在的量成线性关系的，这是荧光成像系统应用于生物学研究的理论基础，激光扫描系统的性能指标主要有：系统分辨率、线性范围、均一性、灵敏度。图3.1 激发能无辐射弛豫能荧光发射能。三种荧光素（绿色：fluorescein；黄色：DNA-bound TOTOT；红色：DNA-bound EB）的激发光波长(a)和发射光波长(b)。为了实现荧光信号的激发、捕获和放大的检测过程，按照顺序荧光成像系统主要包括以下组件：激发源(Excitation resource)、激光传输组件(Light delivery optics)、荧光收集组件(Light collection optics)、发射滤镜(Emission filter)和信号检测放大组件(Detection and amplification)（图3.2）。在荧光成像系统工作的过程中，每个组件的性能都关系着最终荧光信号的收集和检测结果。图3.2 荧光成像系统的基本光学组件和工作原理示意图a. 现有的激发源主要可分为两大类即：宽波长光源，如紫外、氙灯等；单波长非连续光源，如激光光源。前者 主要应用于分光光度计和照相成像系统，可直接照射被检样品。 b. 激光传输组件（Light delivery optics）激光光源还需要一系列透镜和反射镜来导引其完成激发的过程。需要指出的是波长光源也可以通过光栅和滤镜的作用变为窄波长光源。激光传输组件主要在这一过程中起作用。用以将所需波长的光线导向样品，从而保证激发光的单一性。 c. 荧光收集组件（Light collection optics）高质量的光学收集组件应包括透镜、反射镜和滤镜等，负责拟合不同波长的发射光、保证线性关系和透过性。 d. 发射光过滤组件主要通过滤镜来起到收集和过滤杂信号的作用。 e. 信号检测、放大和数字化组件：为了检测荧光光能信号并将其放大、转化成电信号从而迚行定量分析，光电倍增管（PMT）、电荷偶联器（CCD）常被人们所选择。该组件的性能通常通过数字化分辨率来表示,它是用来描述在同样信号强度条件下区分不同两个信号的能力，即人们常说的比特（bit），现多为8-bit，12-bit和16-bit（分别对应为256灰阶、4096灰阶和65536灰阶）。 (3)激光光源的选择:现代荧光成像系统的光源选用最多的有两种即：激光（Laser）光源和发光二极管（LED）光源。两者各有各自的优势和应用范围，客户应根据实际应用领域选择更合适的光源。 激光光源为单波长非连续光，分辨率和灱敏度较高，如氩离子激光光源能产生457nm、 488nm和514nm的激光，尤其是大家熟悉的488nm波长常用来激发蓝色发射光的荧光素物质。除此之外还有氦氖激光（633nm）、Nd:YAG激光(532nm)等，由于是高能光源所以部分配有制冷装置。二极管激光光源相对其他激光光源要更紧凑简洁，可直接整合到图像扫描设备内，也较经济，一般最长激发波长635nm。 发光二极管（LEDs）光源作为荧光成像系统的另外一个选择，激发光带宽相对较宽（大于60nm），能量输出相对较低，所以光源和样品间相聚较近，光程较短。其较激光光源具有更小巧、轻便和经济等特点，应用范围也相当广泛，其激发光最短波长一般大于430nm。(4)荧光信号的两种扫描收集系统：振镜式扫描系统：是通过快速摆动反射镜将反射光信号捕获，从而缩短了二维荧光信号的收集时间，同时适用于收集较厚样品的纵深荧光信号（图3.3）。与此同时，由于收集到的发射荧光信号的角度有一定差别，所以会引起一定的视差偏差效应。通过使用f-theta 透镜可以使这种视差效应引起的失真影响降到最低。 摆头式扫描系统：该扫描系统的信号接收探头与待扫样品每个点的距离是相等的，通过平移探头来实现等距信号的捕获(图3.4)。该系统有效避免了捕获信号的视差失真问题，因为是点对点扫描所以信号获取的扫描时间也较长。(5) 信号的分拣和放大扫描收集得到的不同波长荧光信号的分拣工作是由分光镜或二向色滤光器配合反射镜完成的，在将不同的波长的荧光信号经过分光器分离、折射后，经过发射滤镜过滤到杂信号后到达光电倍增管（PMT）。PMT主要是用来放大分拣后的光信号并将其转化成为电信号(图8)。 PMT的放大倍数通常在106-107间，转化波长范围一般在300-800nm之间。 图3.3 振镜式扫描系统工作示意图 图3.4 摆头式扫描系统工作示意图 图3.5荧光信号的分拣、放大系统工作示意图(6) 基于 CCD的成像系统与激光成像系统不同，基于电荷偶联器(CCD)的照相系统是由聚焦图像到光敏感的 CCD阵列上的发光系统和透镜组件组成。该系统是整合了来源于连续发光样品区域荧光信号的面积图像采集系统，常被应用于通过调节透镜组件来实现固定或可调焦距，从而达到单次捕捉平面图像信号的目的（图3.6）。在此过程中光信号将被转变成电信号，通过模数转换器芯片转换成数字信号并放大。 CCD照相系统的光源多为紫外、白光、光谱氙灯、高能二极管等。针对发射光收集和对于光信号进近不同造成失真可以通过平场校正来修正。 CCD照相系统的性能好坏取决于系统本身的分辨率、灱敏度、线性和动态范围。现有的CCDs上的像素排列范围为6-30m，分辨率在512*512-4096*4096 之间。 CCD阵列对于光、温度和高能射线都很敏感会影响系统的性能，针对CCD迚行制冷，将有利于大幅减少背景噪音并改善系统的灱敏度和线性。如温度为-35C时，CCD的线性范围将增2-5倍，若为了进一步提高其热敏度还可以在捕获过程中将临近的像素合并，当然这可能会影响图像的分辨率。 动态范围指的是完全饱和电荷水平与背景噪音的比值。例如一个成像系统的像素为15*15m、面积为225m2、饱和度为180 000而背景噪音为10，则该成像系统的动态范围为18 000:1，由此可见动态范围受到背景噪音的影响。图3.6 基于电荷偶联器（CCD）的成像原理示意图3.3 荧光成像技术在药物新剂型的应用荧光成像技术具有灵敏度高、时间空间分辨率高、获得信息丰富、适于多参数复合测量等特点，在生物医药领域中应用广泛。荧光探针和共聚焦显微镜的进一步发展使这项技术在生物医药领域中的应用不断扩大。其中，荧光成像技术对药物输送载体的分布和细胞屏障的跨越等方面的研究日益引起药剂学工作者的浓厚兴趣。现就此技术在药物新剂型 ( 如：微球、脂质体、纳米粒等剂型)研究中的新进展进行综述。(1) 在靶向制剂研究中的应用 刘江等发明了能够将治疗药物递送并保留在经常受到癌症和其它疾病侵扰的淋巴系统内的靶向给药系统。在此基础上，通过荧光成像系统的帮助，获得了淋巴系统的成像和可视化形式。荧光成像的检测结果提供了关于涉及肿瘤、尤其是患有恶性病的对象体内无法达到的淋巴结的检测信息，有利于检测其药效，进一步改进靶向药物传递系统。(2) 在微球制剂研究中的应用 李彦艳等建立了一种壳聚糖油酸复合物纳米微球体系，选用阿霉素和利福平做模型药物，检测纳米微球对药物的控释情况。利用荧光探针考查取代度、分子量、有机相、温度、pH等因素对壳聚糖油酸复合物的影响，对改进壳聚糖油酸复合物纳米微球制剂具有重大指导意义。(3) 在脂质体制剂研究中的应用 颉玉胜等研究了各种脂质体制剂对药物的透皮、皮肤贮留量和皮肤分布影响、不同时间点 内荧光素钠的皮肤贮留量；采用激光共聚焦显微成像仪观察荧光素钠在各层的分布，帮助研究脂质体对荧光素钠皮肤分布及贮存的影响。实验结果表明脂质体可提高药物的生物利用度，有利于皮肤病的局部治疗。(4) 在纳米粒制剂研究中的应用 量子点是一类新型无机纳米荧光探针。量子点和荧光成像技术进步加速了集靶向、成像和治疗作用于一体的多功能纳米药物的研发。纳米药物粒度尺寸小，组成材料和结构复杂，其药效评价方法和分析技术手段与其原形药物存在明显差异。能否找到适于纳米药物药效评价的方法和分析手段无疑是纳米药物发展的关键。经典的色谱分析技术在进行纳米药物靶向效率 、药效评价以及体内行为的研究时，不仅操作繁琐，耗资巨大，而且效率较低。然而基于量子点的荧光成像的方法可以克服这一困难。该方法灵敏度高，响应速度快，能够实时动态监测纳米药物在活体细胞或动物体内的行为，并且所需要的仪器设备成本也比较低，可以大大节约纳米药物研发的时问和费用，有助于直观、快速、准确地获取纳米药物在生物体内分布、转运、释放和药效机制等重要信息，为设计和开发临床用纳米药物提供技术支持。刘松等分别采用“一步法”、“ 两步法”合成了荧光硅纳米颗粒。荧光硅纳米颗粒表面可与抗体一类的生物分子结合进而与细胞膜结合，为生物实验提供高度放大和可重现的信号，这方便了纳米制剂的研究。3.4 荧光成像在癌症检测中的应用3.4.1膀胱癌 膀胱癌是西方国家男性最常见的第四种恶性肿瘤，该病复发率高，其治疗和诊断费用相当昂贵。目前临床上白光膀胱镜检查主要用于识别突出表面的大型膀胱癌，却难以检测平坦性癌、不典型增生、多发性增长和微观病变。原位癌(carcinoma in situ，CIS)是预测疾病复发的关键因素，然而白光成像技术检测的CFS图像对比度较差。 荧光成像技术为膀胱癌的检测带了新的希望。1994年，Kriegmair等研究证明膀胱内灌注一氨基酮戊酸( ALA)进行荧光镜检，能够检测出白光膀胱镜无法识别的多种膀胱病变。组织学验证，这种方法检测癌症的敏感性为100。研究人员经过一系列实验证明，与传统的成像技术相比ALA诱导的Pp PFD具有更高的诊断效率。这些实验，值得注意的是ALA诱导的Pp荧光技术能够清晰地识别易被膀胱镜忽略的CIS。Riedl等对荧光组的后期随访表明，与白光成像技术相比，荧光成像有效地降低了表浅膀胱癌早期复发的比例。比较 ALA诱导的Pp成像与膀胱镜引导经尿道肿瘤切除手术的三期临床试验结果显示，随访中61.5的Pp荧光内镜组患者没有肿瘤复发，而对照组只有4 0.6的患者无肿瘤复发，手术过程不良反应无显著差异。虽然ALA作为光敏剂前体用于PFD检测具有良好的效果，然而ALA在恶性肿瘤组织中的生物利用度存在缺陷，促使Lange等研究开发亲脂性的己基氨基酮戊酸(HAL)用于膀胱癌诊断成像。在此应用中，研究人员发现HAL能更好地渗透膀胱各层，并能更均匀地分布在肿瘤组织中，只需低剂量HAL便能产生较高的荧光发射强度。2003年以来，使用HAL取代ALA进行的膀胱癌荧光镜检的灵敏度与白光成像技术相比有了显著提高。近年来其他光敏剂也被用于膀胱癌检测。金丝桃素荧光检测，光敏剂荧光数据不仅能用于疾病的检测还能用于其病理分级。3.4.2 脑部肿瘤 荧光引导切除术(fluorescenceguided resection，FGR)在脑部肿瘤治疗中的作用逐渐引起人们的关注。恶性肿瘤切除过程中，周围正常组织区域的损伤程度决定脑肿瘤患者无进展生存率及其生活质量。然而对于恶性肿瘤来说白光成像系统无法有效地界定肿瘤 边缘。Stummer等提出将荧光成像应用到脑肿瘤的切除手术中。他们在加入ALA的恶性胶质瘤细胞中观察到大量的卟啉聚集，并在部分患者中证实了这项发现。随后，Stummer等又对52例多形性恶性胶质瘤患者进行了术中荧光成像的临床试验评估，ALA诱导的Pp荧光成像下行手术切除能够使大部分(63)患者的肿瘤完全切除。这项工作之后进行的大规模多通道三期临床试验中，患者被随机地分为传统的显微手术组或PpIXFGR并口服ALA 组， 两种治疗方法都伴以辅助的放射治疗，270例患者手术后MRI结果显示，FGR组65的患者无残端疾病，白光组仅36患者无残端疾病。然而值得注意的是，尽管在术后前6个月FGR组的无进展存活率和生活质量大幅改善，但是大约术后l5个月左右两组生存曲线逐渐趋于一致。不过，考虑到对恶性胶质瘤切除手术所带来的显著的临床挑战，无进展生存率的提高无疑是改善疾病临床管理的重大进步。在此基础上Zimmermann等进行一项早期二期临床试验，评估替莫泊芬(四间羟基苯基二氢卟吩，mTHPC，Foscan)用于恶性脑胶质瘤FGR的作用。试验评估了22例脑肿瘤患者的13个样品，结果显示药物的敏感性和特异性分别为 87.9和95.7。此外有10例白光未能诊断出的肿瘤能够被mTHPC荧光正确识别。Zimmermann等建议，由于