油菜内生真菌的分离及其抑菌活性的研究.doc

油菜内生真菌的分离及其抑菌活性的研究安徽农业科学,JournalofAgri.Sci.2008,36(1O):42874288责任编辑刘月娟责任校对.马君叶油菜内生真菌的分离及其抑茵活性的研究王丽娟,刘苏萌,司艳红,何培新(郑州轻工业学院食品与生物工程学院,河南郑州删2)摘要目的探讨油菜内生真菌的抑茵活性.方法从油菜的不同组织内分离内生真菌,研究它们对植物病原真菌的抑制作用,并对.活J陛菌株进行了初步鉴定.结果从油菜的根,茎,叶中共分离出12株内生真菌,其中2株(WC5和wlJ2)对病原真菌均有不同程度的抑制作用,尤其对油菜茵核病菌和小麦黄斑叶枯病菌的抑制率最高,而且其发酵滤液经高温处理后活性不丧失,对痛原真菌仍有较强的抑制作用,具有一定的生防潜能.结论油菜内生真茵可以产生具有抑茵活性的次生代谢产物,为新型活性物质的筛选提供新的途径.关键词油菜;内生真菌;分离;抑茵活性;生物防治中图分类号$565.4文献标识码A文章编号l7661l(2oo)lO一0428702IsolationandAntifimgalActivityofEnaoohyncF1inBrassican呼哪WANGlJ-jwetai(SchoolofFoodand13ioeeering,ZhengzhouUniversityofLightIndustry,Zherou,Hen,an450(102)Al【Objective,IheantlfuactivityofendophyticfungiinBrassicartapusWaSstued.Method,Iheendophytiefungi眦isolatedandiden.tiffedfromdifferenttissuesofBrassicanapus.rn1eantifungalactivitytos0rIleplantpathogem惝detected.ResultTwelveendophyticfungalstrdirl8wereisolatedfromroots,stemsandleavesofBrassicanapuswhichincludedtwostrainsnamedWG5andWJ2that.withantagonismonplantpathoger.CulturefiltrateofthetwoSdJI1Scouldinhibitthegrowthofplantpathogens.AnditwasmoreeffectiveagairlstSclerotiniasclerotiorumandtS,renophoratriticire-pentis,andtheantifungalactivitysurvivedafterheattzealment.Soithaspotentialcapabilityofbiologicalcontro1.Conelusi0nISeconametaboliteswithantlfungalactivityc8nhepuceclfromendophytiefungiinBrassicanapus.Theresearchprovidedanapproachtosclenoutnactivematerials.KeywordsBrassk:anapus;Endophytiefungi;Isolation;Antifungalactivity;Biologicalcontrol植物内生真菌是指整个生活史或生活史的某一阶段生长在植物组织细胞间隙或细胞内而不引起明显病害症状的真菌,是植物微生态系统中的天然组成成分,具有丰富的生物多样性uI4J.近年来的研究表明,健康植物体内存在的某些内生真菌能产生与宿主相同或相似的具有生理活性的代谢产物l5-6J,是植物病害生物防治的潜在资源菌.笔者从油菜的不同组织内分离出多种内生真菌,并且研究其对几种病原真菌的抑制作用,对于利用其进行油菜生物防治,维护农田生态平衡等具有一定的理论和实际意义.1材料与方法1.1材料1.1.1供试材料.甘蓝型油菜(Brossicanapus),采自郑州市农业路与桐柏路交叉口农田,郑州市须水镇农田,通许县云庄农田.采样时,挑选无病害症状,无虫孔的健康植株,采集后2h内进行表面消毒处理.1.1.2培养基.马铃薯葡萄糖培养基(PDA),马铃薯液体培养基(PDB).1.1.3供试植物病原真菌.小麦全蚀病菌(Gaeumammycesgraminisvat.tritici),小麦黄斑叶枯病菌(Pyrenophoratritici.re.pentis),油菜菌核病菌(Sclerotiniasderotiomm),棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporumsp.vasinfectum),立枯丝核病菌(Rhizocto.niaceredis)和小麦赤霉病菌(Fusariumgrominearum),均由郑州轻工业学院生物技术实验室提供.1.2方法1.2.1内生真菌的分离方法.分离材料用自来水冲洗,然后依次用75%酒精漂洗1rriln,0.1%升汞漂洗3rffln,75%酒精漂洗30s.无菌水漂洗5次进行表面消毒.消毒后的材料用无菌手术剪剪成叶(23)mm(23)mm,根和茎(24)mm的片断,置于PDA一氨苄青霉素平板(10o腭/rn1)上,28避光培养37d.对照试验中每块平板放23根经过表面作者简介王丽娟(1978一),女,河南郑州人,硕士,助教,从事微生物遗传方面的研究.*通讯作者.收稿日期2007.12.17消毒的油菜组织,不剪碎,同等条件下培养.观察材料切口处长出菌丝(菌落),取切口处菌丝,转接至新PDA培养基上继续培养,纯化,并对菌株进行编号,保存6-7.1.2.2活性菌株的筛选及鉴定方法.采用平板对峙法J.在PDA平板上测定所分离出的内生真菌对供试病原真菌的抑制作用,筛选出活性菌株.根据真菌鉴定手册,半知菌属图解,对活性菌株进行鉴定I9J.1.2.3活性菌株抑菌活性的测定.1.2.3.1菌饼法.将活性菌株制成直径5lnm的菌饼,置于含供试病原真菌的PDA培养基上.设3个重复,用未接菌饼的PDA培养基作空白对照,28培养37d,测定抑菌圈直径,计算抑菌率.抑菌率=蓖蕴100%(1)1.2.3.2滤纸片扩散法.接种活性菌饼于PDB培养基中,以空白培养基作对照,25oC,180r/rain振荡培养7d后,取出培养物,过滤除菌得到无菌滤液.取一半无菌滤液经高温(121cc)处理30min后,与另一半分别用乙酸乙酯萃取3次,萃取液减压浓缩后得到2种粗品代谢物,备用.空白培养基过滤后,做相同处理,作为CK,备用.将上述所得粗品代谢物分别配成10nwn丙酮溶液,cKl作相同处理.然后,取无菌滤纸片(5mm)浸于粗品丙酮溶液中,使其充分饱和,略微风干后,接于含有供试病原菌的PDA平板中,设3个重复,以丙酮作为cK2.将制好后的平板在28的条件下培养37d,测定抑菌圈直径,计算抑菌率.2结果与分析2.1内生真菌的分离采用表面消毒法,从油菜组织中共分离出12株内生真菌,其中从根中分离出6株,分别命名为WG1一WG6;从茎中分离出3株,分别命名为WJ1一WJ3;从叶中分离出3株,分别命名为WYIWY3.2.2活性菌株的筛选与鉴定在l2株油菜内生真菌中,有l0株内生真菌对一种或几种病原真菌有不同程度的抑菌作4288安徽农业科学2OO8生用,活性菌株数占分离菌株总数的83.3%,其中WG5和WJ2对供试病原真菌有广谱的抑菌效果,表明这2种内生真菌中存在着广泛的抗植物病原真菌的微生物资源.内生真菌可以在不接触病原真菌的条件下分泌抑菌活性物质,从而抑制病原真菌的生长.对WG5和WJ2菌株进行初步鉴定,发现WG5菌落白色,短绒毛状,菌丝稀疏,基质浅褐色,分生孢子梗集成分生孢子座,细长,分枝,分生孢子双细胞,个别的三胞,大孢子弯曲呈不明显的镰刀形,属于丛梗孢目,瘤座孢科,镰孢霉属;WJ2菌落初白色,渐变为黑色,菌丝稀疏,基质黑褐色,分生孢子梗单枝,长短不一,顶生不分枝,分生孢子有纵横隔膜,倒棍棒形,卵形,属于丛梗孢目,暗色孢科,链格孢属.2.3活性菌株抑菌活性2,3.1活陛菌株对病原真菌的抑制作用.由表I可知,活陛菌株WG5和WJ2对供试病原真菌均有不同程度的抑制作用,两者对油菜菌核病菌表现出很强的抑制作用,可作为抑菌活性成分分离纯化的研究材料.2.3.2活性菌株代谢物对病原真菌的抑制作用.由表2和表3可知,活性菌株WG5和WJ2的代谢产物对供试病原菌的抑制作用与活菌测定的结果基本一致.经高温处理后,发酵产物滤液抑菌活性成分基本不丧失,对供试病原真菌仍有较强的抑制作用,说明代谢物的活性成分为胞外代谢产物,且具有耐高温的特点.表1活性菌株对病原真菌的抑制率%酬e1bi衄rate0fanfithogmiedrainstopatll0g咄病原真菌活性菌株St商nVungic0deWG5WJ2表2WG5代谢物对病原真菌的抑制率ble2tingrate0fWG5melabolitestop习曲0g眄Iicfl岫%3结论与讨论油菜中存在着丰富的内生真菌资源,对病原真菌具有抑制作用的活性菌株比例较高.油菜内生真菌可以产生具有抑菌活性的次生代谢产物,为活性物质的筛选提供新的途径.从油菜中分离出的12株内生真菌中,WG5的抑菌活性作用最强,经鉴定属于镰孢霉属.镰孢霉属真菌是产活性物质的真菌类群,其抗肿瘤,杀有害昆虫,杀根结线虫等活性作用已有相应研究l,而其菌株产生的次生代谢产物的结构,性质和生防作用等则有待于进一步研究.参考文献1任安芝,高玉葆,植物内生真菌一一类应用前景广阔的资源微生物f.1.微生物学请报,2001,28(6):9093,2梁宗琦.真菌次生代谢产物多样性及其潜在应用价值J.生物多样性1999.7(2):l45150.3郭良栋.内生真菌研究进展J.菌物系统,2001,加(1):l48一l52.4周成,邵华,张玲琪,等.植物内生真菌研究的应用潜力分析J.天然产物研究与开发,2002,14(2):6972.5李海燕,刘丽.产生活性物质植物内生菌的研究进展J1.天然产物研究与开发,2OO4,l6(5):482485.16jLUH,ZOUWX,MENGJC,daI.Newoaefivepl,odubyColMorichumsp.,anendophehJngusArterneiaanl1u