沈阳药科大学毕业论文1.doc

可编辑修改 沈沈 阳阳 药药 科科 大大 学学 本本 科科 毕毕 业业 论论 文文 论文题目 论文题目 HPLCHPLC 同时测定了哥王中同时测定了哥王中 4 4 种香豆素的含量种香豆素的含量 起止时间 起止时间 20122012 年年 1010 月月 0909 日日 20132013 年年 6 6 月月 1010 日日 姓名学号 姓名学号 学院专业 中药学院中药学专业学院专业 中药学院中药学专业 年级班级 年级班级 20092009 级中药学一班级中药学一班 指导教师 指导教师 实习单位 药学院药物分析教研室实习单位 药学院药物分析教研室 沈阳药科大学本科毕业论文 目 录 目目 录录 摘 要 1 A Ab bs st tr ra ac ct t 2 第一章 前言 3 1 1 香豆素类化合物的基本知识 3 1 1 1 香豆素类化合物的基本结构 3 1 1 2 香豆素类化合物分类 3 1 1 3 香豆素类化合物的药理活性 4 1 2 研究思路与立题依据 6 第二章 实验部分 7 2 1 实验材料 7 2 2 溶液的配制 7 2 2 1 对照品溶液的制备 7 2 2 2 供试品溶液的制备 8 2 3 色谱条件与系统适用性试验 8 2 4 方法学验证 9 2 4 1 线性关系考察 9 2 4 2 检测限与定量限的确定 9 2 4 3 精密度试验 9 2 4 4 稳定性试验 10 2 4 5 重复性试验 10 2 4 6 回收率试验 10 2 5 样品含量测定 10 第三章 结果与讨论 13 3 1 结果 13 3 2 讨论 13 参考文献 14 致 谢 16 可编辑修改 HPLC 同时测定了哥王中 4 种香豆素的含量 摘 要 目的 目的 建立 HPLC 同时测定了哥王中伞形花内酯 西瑞香素 7 O D 葡萄糖苷 triumbelletin 西瑞香素的含量 方法 方法 该方法采用依利特 Hypersil ODS 色 谱柱 200 mm 4 6 mm 5 m 乙腈 0 1 磷酸水溶液为流动相梯度洗脱 检测 波长 345 nm 流速 1 0 mL min 1 柱温 30 进样量 20 L 结果 结果 伞形花内 酯 西瑞香素 7 O D 葡萄糖苷 triumbelletin 西瑞香素的质量浓度分别 在 0 070 0 770 r 0 9999 0 190 2 09 r 0 9999 0 765 8 42 r 0 9998 4 08 44 9 mg L 1 r 0 9999 与峰面积呈良好的线性关系 平均 回收率分别为 98 0 RSD 1 9 96 6 RSD 1 2 96 5 RSD 1 7 101 3 RSD 1 1 结论结论 该方法简便 快速 结果准确 可作为了哥王药材 的质量控制方法 关键词 关键词 了哥王 HPLC 伞形花内酯 西瑞香素 7 O D 葡萄糖苷 triumbelletin 西瑞香素 含量测定 可编辑修改 SimultaneousSimultaneous determinationdetermination ofof fourfour coumarinscoumarins inin WikstroemiaWikstroemia indicaindica L L C C A A Mey Mey byby HPLCHPLC AbstractAbstract Objective Objective To establish a reversed phase high performance liquid chromatographic method for simultaneous determination of 4 coumarins in Wikstroemia indica L C A Mey Method Method The chromatographic separation was performed on an Elite Hypersil ODS column 4 6 mm 200 mm 5 m with a gradient elution of acetonitrile 0 1 phosphoric acid aqueous solution as the mobile phase the UV detection wavelength was set at 345 nm the flow rate was 1 0 mL min 1 the column temperature was maintained at 30 and the injection volumn was 20 L Result Result All the standard compounds showed a good linearity in the relatively wide concentration range of 0 070 0 770 r 0 9999 0 190 2 09 r 0 9999 0 765 8 42 r 0 9998 4 08 44 9 mg L 1 r 0 9999 for umbelliferone daphnoretin 7 O D glucoside triumbelletin and daphnoretin respectively Under these conditions the average recoveries of the four coumarins were 98 0 96 6 96 5 101 3 respectively and the relative standard deviations RSD were 1 9 1 2 1 7 1 1 respectively Conclusion Conclusion The developed method was found to be accurate sensitive and reproducible and could be successfully applied to the quality control of Wikstroemia indica L C A Mey KeyKey wordswords Wikstroemia indica L C A Mey HPLC umbelliferone 可编辑修改 daphnoretin 7 O D glucoside triumbelletin daphnoretin content determination 可编辑修改 第一章 前言 瑞香科植物在世界上约有 48 属 650 种以上 广泛分布于南北半球的热带和亚热带地区 多分布于非洲 大洋洲和地中海沿岸 我国有 10 属 100 种左右 其中主要以瑞香属和荛花 属居多 各省均有分布 但主产于长江流域及以南地区 该科植物多有一定毒性 对皮肤 及粘膜有强烈刺激性 可供药用植物不多 但近年来进行了大量的化学工作 分离得到了 许多重要化合物的结构 其相关药理实验表明该科植物具有多种显著的生理活性 引起了 各国学者的关注 了哥王 Wikstroemia indica L C A Mey 为瑞香科荛花属植物 又名岭南荛 花 分布于我国浙江 江西 福建 湖南 广东 广西等省区 了哥王性味苦寒 微辛 有毒 具有清热解毒 化痰散结 消肿止痛等作用 主治风湿性关节炎 扁桃体炎 痈 肿 跌打损伤等 1 已知了哥王含有黄酮类 香豆素类 多糖类 木脂素类 挥发油类 甾体类 皂苷类等成分 2 4 1 11 1香豆素类化合物的基本知识香豆素类化合物的基本知识 1 1 11 1 1 香豆素类化合物的基本结构香豆素类化合物的基本结构 香豆素 Coumarin 化学名称为2H 1 苯并吡喃 2 酮 2H 1 Benzopyran 2 one 即苯并 吡喃酮 香豆素是顺式 邻羟基桂皮酸的内酯 是一种具有芳香气味的化合物 其化学结构式见图图1 11 1 OO 图图1 11 1 香豆素的化学结构式香豆素的化学结构式 Fig 1 1Fig 1 1 ChemicalChemical structurestructure ofof coumarincoumarin 1 1 21 1 2 香豆素类化合物分类香豆素类化合物分类 5 香豆素类化合物主要分为以下几类 1 简单香豆素类 这类化合物是指仅在苯环有取代基的香豆素类 绝大多数香豆 素在C 7位都有含氧基团存在 仅少数例外 其他C 5 C 6 C 8位也有含氧基团取代的 可能 常见的含氧基团有羟基 甲氧基 亚甲二氧基 这类香豆素常见的有伞形科植物 中的伞形花内酯 瑞香中的瑞香素 蛇床子中的蛇床子素 独活中的当归内酯等 2 呋喃香豆素类 furocoumarins 苯环上的异戊烯基与其邻位的酚羟基环缩合 可编辑修改 而成 的化合物 成环后常伴随着降解 失去3个碳原子 根据呋喃环的位置 此类化合物通常 被分为线型 linear 和角型 angular 如存在于补骨脂中的补骨脂内酯 旱前胡中的 旱前胡甲素 旱前胡乙素等 3 吡喃香豆素类 pyranocoumarins 由香豆素苯环上的异戊烯基与邻位的酚羟 基环缩合形成2 2 二甲基 吡喃环结构的化合物 与呋喃香豆素类似 根据吡喃环环合 的位置 也分为角型和线型两种类型 如狭缝芹中的狭缝芹素 白花前胡中的北美芹素 白花前胡丙素等 4 异香豆素类 isocoumarin 是香豆素的异构体 分布比较零散 局限在少数 科属中 5 其他香豆素类 从植物中发现的天然香豆素类成分 还有些化合物的结构不能 归属于上述4种类型 常见的取代基有苯基 羟基 异戊烯基等基团 如茵陈中的茵陈素 白花丹中的白花丹精等 1 1 31 1 3 香豆素类化合物的药理活性香豆素类化合物的药理活性 香豆素类物质具有多种多样的生理活性 对植物有双重生理活性 在低浓度时促进 植物生长 在高浓度时抑制植物生长 对人体则具有抗肿瘤 抗HIV 抗菌 抗凝血 抗 氧化 消炎止痛 止咳平喘 降压等作用 特别是某些衍生物具有抗肿瘤活性和抗HIV活 性 引起了国内外学者广泛的关注 1 1 抗肿瘤作用抗肿瘤作用 通过对香豆素类化合物的抗肿瘤作用研究 发现许多香豆素类化合物具有抗肿瘤活 性 为抗肿瘤药物的研发提供了先导化合物 双香豆素在临床上作为凝血剂广泛使用 双香豆素是NADPH 醌类氧化还原酶 的 竞争性抑制剂 可以增加细胞内过氧化物的生成和影响肿瘤细胞的增殖 Gonzalez Aragon等 6 研究首次表明 双香豆素可以抑制骨髓性白血病HL 60细胞内线粒体的电子传 送 逆转复合体II电子流方向引起过氧化物释放 并且抑制嘧啶的生物合成 Kostova等 7 研究了三种双香豆素衍生物铈配合物的细胞毒性 实验中使用急性骨髓性白血病HL 60 细胞株和慢性骨髓性白血病 CML BV 17细胞株 通过凝胶电泳分析DNA来评价化合物引 起程序细胞死亡的能力 此外 还阐明了程序细胞死亡的形态学特征 2 2 抗炎镇痛作用抗炎镇痛作用 Tsai等 8 研究发现白花丹属植物中的吡喃香豆素Seselin能抑制植物凝集素 PHA 可编辑修改 这种植物凝集素能刺激人类周边血液中单核细胞 PBMC 增殖 IC50为 53 87 0 74 M 可编辑修改 Seselin抑制PBMC增殖并不是通过细胞毒性 而是通过抑制炎症性细胞因子白介素2 IL 2 和干扰素 IFN 此外 Seselin能显著抑制PBMC中IL 2和IFN 的基因表达 3 3 对心血管系统的作用对心血管系统的作用 天然香豆素类化合物对心血管系统的作用机制主要是基于其钙离子拮抗剂的作用 具有心血管活性的天然香豆素可抑制钙离子经钙通道进入细胞 从而产生降压 抗心律 失常 负性肌力等生物学作用 Dongmo等 9 从植物Mammea africana茎皮分离得到的4 n propylcoumarins 4 phenylcoumarins表现出微弱的血管松弛作用 4 4 抗菌及抗微生物作用抗菌及抗微生物作用 Ferreira等 10 从植物Helietta apiculata茎皮中分离得到3 1 二甲基烯丙基 紫 花前胡醇当归酯和叙利亚芸香素 heliettin 在体外对利什曼原虫的前鞭毛体形 式作用温和 IC50为450 g mL 1 对感染亚马逊利什曼原虫的小鼠疗效显著 5 5 抗抗HIVHIV作用作用 Sancho等 11 研究发现欧前胡素有明显的抗HIV 1活性 Zhou等 12 从五福花阿魏根中 分离得到的水合氧化前胡素 独活醇 氧化前胡素和甲酸氧化前胡素具有明显的抗HIV作 用 Shikishima等 13 从Prangos tschimganica分离得到的补骨脂素能抑制H9淋巴细胞中 HIV 1复制 EC50为0 1 g mL 1 抑制未受感染的H9淋巴细胞增殖 IC50为19 1 g mL 1 治疗指数TI为191 通常TI大于5就认为药物有治疗作用 石当归素和佛手内酯也有很强 的抗HIV活性 TI分别为11 7和69 9 1 1 41 1 4 香豆素类化合物的含量测定方法香豆素类化合物的含量测定方法 香豆素类化合物的含量测定方法有 高效液相色谱法 比色法 荧光法 核磁共振 波谱法 紫外分光光度法 气相色谱法 薄层扫描法 极谱法等 国外研究者还报道了 几种改进的技术 如胶束电动毛细管技术 直角纳米通道技术 凝胶溶胶通道技术等来 检测香豆素类物质 14 目前 应用最多的是高效液相色谱法 选用合适的色谱柱和流动 相 可以很好地分离许多香豆素类物质 顾源远等 15 采用紫外分光光度法测定明党参中总香豆素的含量 以珊瑚菜内酯为对 照品 检测波长为268 nm 并对该方法的重复性 稳定性 精密度及加样回收率进行试 验 该法简便 可靠 为有效控制明党参药材的质量奠定了一定基础 周兴旺等 16 等用 双波长薄层扫描法测定了5种产地的地骨皮药材中莨菪亭 Scopoletin 的含量 以山西 产地骨皮 LyciumchinenseMill 的含量最高 郑丽容等 17 用高效液相色谱法测定复方 可编辑修改 胆通胶囊中羟甲香豆素的含量 方法简单 快速 准确 刘丽霞等 18 采用HPLC法测定了 哥王中伞形花内酯的含量 为完善了哥王药材质量控制提供数据 李艳敏等 19 采用HPLC 法测定了哥王中西瑞香素的含量 具有操作简便准确 回收率好 精密度 重现性高 分析快速的优点 可作为了哥王药材的质量控制方法 1 21 2 研究思路与立题依据研究思路与立题依据 香豆素类化合物具有抗 HIV 抗癌 降压 抗心律失常 抗骨质疏松 镇痛 平喘及 抗菌等多种生物活性 具有潜在的药用价值 其中抗肿瘤作用是一个研究热点 因此 研 究开发更多的天然植物香豆素类成分 寻找高效低毒的香豆素类化合物及其衍生物已成为 当今药物研究与开发工作的重中之重 香豆素类成分是了哥王药材中主要的抗肿瘤活性成分之一 且含量较大 目前 在 了哥王中香豆素的含量测定方面 仅是关于西瑞香素和伞型花内酯的研究 相关报道有 限 不足以作为评价药材质量的标准 因此 有必要对了哥王香豆素类化合物的质量控 制进行深入系统的研究 以期提供了哥王抗肿瘤活性的物质基础 寻找了哥王中有效可 控成分 完善了哥王的质量控制标准 基于上述情况 本文拟采用的基本研究思路如下 拟建立HPLC同时测定不同产地了 哥王中伞形花内酯 西瑞香素 7 O D 葡萄糖苷 triumbelletin 西瑞香素的含量 可编辑修改 第二章 实验部分 2 12 1 实验材料实验材料 仪器仪器 LC 20A 高效液相色谱仪日本 SHIMADZU SPD 20A 紫外检测器日本 SHIMADZU LC solution 色谱工作站日本 SHIMADZU TG332A 分析天平湘仪天平仪器厂 KQ5200B 型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司 QE100 药材粉碎机浙江省武义县屹立工具有限公司 试剂试剂 甲醇 色谱纯 山东禹王实业有限公司禹城化工厂 乙腈 色谱纯 山东禹王实业有限公司禹城化工厂 纯净水杭州娃哈哈集团有限公司 甲醇 分析纯 天津市富宇精细化工有限公司 无水乙醇 分析纯 天津市富宇精细化工有限公司 磷酸 色谱级 天津市科密欧化学试剂有限公司 药材 了哥王药材 9 批 分别购于云南 江西 四川等地 由沈阳药科大学孙启时 教授鉴定为瑞香科荛花属植物了哥王 Wikstroemia indica L C A Mey 的干燥根 茎 对照品 伞形花内酯 天津马克生物技术有限公司 批号 20120308 纯度大于 99 0 西瑞香素 7 O D 葡萄糖苷 triumbelletin 西瑞香素 本实验室自制 纯度均大于 98 5 4 种香豆素化合物的结构见附图附图 2 12 1 2 22 2 溶液的配制溶液的配制 2 2 12 2 1 对照品溶液的制备对照品溶液的制备 分别取干燥至恒重的伞型花内酯 西瑞香素 7 O D 葡萄糖苷 triumbelletin 西瑞香素对照品约适量 精密称定 分别置 25 100 25 25 mL 的量瓶中 用体积分数 为 80 的甲醇溶解并稀释至刻度 摇匀 制成质量浓度分别为 70 00 15 80 85 0 204 2 mg L 1的伞型花内酯 西瑞香素 7 O D 葡萄糖苷 triumbelletin 西瑞香素对照品储备液 分别精密量取上述对照品储备液 0 50 6 0 4 5 10 mL 至 25 mL 量瓶中 用体积 可编辑修改 分数为 80 的甲醇稀释至刻度 摇匀 即得质量浓度分别为 1 400 3 792 15 30 81 68 mg L 1的伞型花内酯 西瑞香素 7 O D 葡萄糖苷 triumbelletin 西瑞香素混合对照品储备液 4 备用 2 2 22 2 2 供试品溶液的制备供试品溶液的制备 取了哥王干燥药材细粉 过 60 目筛 约 0 7 g 精密称定 置 50 mL 具塞锥形瓶中 精密加入体积分数为 80 的甲醇 30 mL 密塞 精密称定其重量 超声处理 45 min 放冷 再称定其重量 用提取溶剂补足失重 摇匀 经 0 45 m 微孔滤膜过滤 取续滤液 即 得 2 32 3 色谱条件与系统适用性试验色谱条件与系统适用性试验 依利特 Hypersil ODS 色谱柱 200 mm 4 6 mm 5 m 流动相 乙腈 A 0 1 磷 酸水溶液 B 梯度洗脱程序 0 5 min 18 A 6 20 min 20 A 23 33 min 30 A 34 39 min 50 A 39 42 min 18 A 41 45 min 18 A 流速 1 0 mL min 1 检测波长 345 nm 柱温 30 进样量 20 L 在上述色谱条件下 伞形花内酯 西 瑞香素 7 O D 葡萄糖苷 triumbelletin 西瑞香素的理论塔板数均大于 3000 与相 邻峰间的分离度均大于 1 5 色谱峰对称因子均在 0 95 1 05 典型色谱图见附图附图 2 22 2 O O HO O OO O O MeO Glc O a a b b O OOO H3C HOO O c c d d 图图 2 12 1 伞形花内酯 西瑞香素伞形花内酯 西瑞香素 7 7 O O D D 葡萄糖苷 葡萄糖苷 triumbelletintriumbelletin 西瑞香素的化学结构式 西瑞香素的化学结构式 Fig 2 1Fig 2 1 StructuresStructures ofof umbelliferoneumbelliferone a a daphnoretin 7 daphnoretin 7 O O D D glucosideglucoside b b triumbelletintriumbelletin c c andand daphnoretindaphnoretin d d 可编辑修改 1 umbelliferone 1 umbelliferone 2 daphnoretin 7 2 daphnoretin 7 O O D D glucoside glucoside 3 triumbelletin 3 triumbelletin 4 daphnoretin4 daphnoretin 图图 2 22 2 混合对照溶液混合对照溶液 A A 和供试品溶液和供试品溶液 B B 的高效液相色谱图的高效液相色谱图 Fig 2 2Fig 2 2 HPLCHPLC chromatogramschromatograms ofof standardstandard solutionsolution A A andand samplesample solutionsolution B B 2 42 4 方法学验证方法学验证 2 4 12 4 1 线性关系考察线性关系考察 精密量取混合对照品储备液 0 5 1 5 2 5 3 5 4 5 5 5 mL 分别置 10 mL 量 瓶中 加体积分数为 80 的甲醇稀释至刻度 摇匀 得伞型花内酯 西瑞香素 7 O D 葡萄糖苷 triumbelletin 西瑞香素的系列标准溶液 按 2 32 3 项下色谱条件进样测 定 记录色谱图 以对照品溶液质量浓度 mg L 1 为横坐标 峰面积 A 为纵坐标 绘 制标准曲线 得伞型花内酯 西瑞香素 7 O D 葡萄糖苷 triumbelletin 西瑞香素 的回归方程 分别为 Y 8 348 104X 3 292 102 r 0 9999 Y 7 291 104X 2 776 103 r 0 9999 Y 7 203 104X 2 899 102 r 0 9998 Y 8 024 104X 1 620 104 r 0 9999 结果表明伞型花内酯 西瑞香素 7 O D 葡萄糖苷 triumbelletin 西瑞 香素分别在 0 070 0 770 0 190 2 09 0 765 8 42 4 08 44 9 mg L 1与峰面积呈良好 线性关系 2 4 22 4 2 检测限与定量限的确定检测限与定量限的确定 分别将伞型花内酯 西瑞香素 7 O D 葡萄糖苷 triumbelletin 西瑞香素对照 品溶液稀释成不同的质量浓度进行 HPLC 分析 测得其检测限 信号 S 和噪音 N 的比值 S N 3 分别为 3 5 7 9 8 5 4 1 ng ml 1 定量限 信号 S 和噪音 N 的比值 S N 10 分 别为 7 0 15 8 21 3 10 2 ng ml 1 2 4 32 4 3 精密度试验精密度试验 精密吸取 2 2 12 2 1 项下系列标准溶液 伞型花内酯 西瑞香素 7 O D 葡萄糖苷 AB 可编辑修改 triumbelletin 西瑞香素的质量浓度分别为 0 350 0 948 3 82 20 4 mg L 1 20 L 按 2 32 3 项下色谱条件连续进样 6 次 记录峰面积 结果伞型花内酯 西瑞香素 7 O D 葡萄糖 苷 triumbelletin 西瑞香素峰面积的 RSD 分别为 0 88 0 56 1 1 0 31 结果 表明仪器精密度良好 2 4 42 4 4 稳定性试验稳定性试验 取供试品溶液 室温放置 按 2 32 3 项下色谱条件 分别在 0 2 4 6 8 10 12 24 h 进样测定 记录峰面积 伞型花内酯 西瑞香素 7 O D 葡萄糖苷 triumbelletin 西瑞香素峰面积的 RSD 分别为 1 9 2 3 1 9 1 8 结果表明供试品溶液室温放置 24 h 内稳定性良好 2 4 52 4 5 重复性试验重复性试验 取了哥王干燥药材细粉 过 60 目筛 No 3 按 2 2 22 2 2 项下方法平行制备 6 份供试溶 液 按 2 32 3 项下色谱条件进样测定 测得伞型花内酯 西瑞香素 7 O D 葡萄糖苷 triumbelletin 西瑞香素的平均含量分别为 0 0108 0 0440 0 272 1 26 mg g 1 RSD 分别为 1 3 1 5 1 2 1 3 结果表明方法的重复性良好 2 4 62 4 6 回收率试验回收率试验 采用加样回收试验法 取已知含量 伞型花内酯 西瑞香素 7 O D 葡萄糖苷 triumbelletin 西瑞香素的平均含量分别为 0 0108 0 0440 0 272 1 26 mg g 1 的了 哥王干燥药材细粉 过 60 目筛 No 3 约 0 35 g 共 9 份 精密称定 分别加入低 中 高 3 个质量浓度的对照品溶液 分别相当于药材原有含量的 80 100 120 每一质 量浓度取 3 份 按 2 2 22 2 2 项下方法制备供试品溶液 按 2 32 3 项下色谱条件进样测 定 计算加样回收率 伞型花内酯的平均回收率为 98 0 RSD 为 1 9 n 9 西瑞香素 7 O D 葡萄糖苷的平均回收率为 96 6 RSD 为 1 2 n 9 triumbelletin 的平均 回收率为 96 5 RSD 为 1 7 n 9 西瑞香素的平均回收率为 101 3 RSD 为 1 1 n 9 结果表明回收率试验符合要求 方法的准确度良好 计算结果见表表 2 12 1 2 52 5 样品含量测定样品含量测定 取 9 个产地的了哥王干燥药材细粉 过 60 目筛 按 2 2 22 2 2 项下方法操作 其中 No 2 No 5 和 No 7 供试品溶液分别稀释 5 倍 2 5 倍和 2 倍后进行 HPLC 测定 按 2 32 3 项下色谱条件进样测定 按标准曲线法计算伞型花内酯 西瑞香素 7 O D 葡 萄糖苷 triumbelletin 西瑞香素的含量 结果见表表 2 22 2 可编辑修改 可编辑修改 表表 2 12 1 了哥王中了哥王中 4 4 种香豆素的回收率测定结果种香豆素的回收率测定结果 Table 2 1Table 2 1 RecoveriesRecoveries ofof thethe fourfour coumarinscoumarins inin WikstroemiaWikstroemia indicaindica L C A Mey L C A Mey n n 9 9 Marker compoud morigin gmadded gmfound g Recovery Average RSD 3 7993 1506 84796 8 3 8053 1506 85596 8 3 8033 1506 94199 6 3 8143 8507 51996 2 3 7893 8507 643100 1 3 7993 8507 47795 5 3 8014 5508 24097 6 3 7884 5508 30399 2 umbelliferone 3 7944 5508 366100 5 98 01 9 15 4812 3227 6398 6 15 5012 3227 6298 4 15 4912 3227 3396 1 15 5415 3330 3096 3 15 4415 3330 2096 3 15 4815 3330 1595 7 15 4818 3333 1496 3 15 4318 3332 8995 2 daphnoretin 7 O D glucoside 15 4618 3333 2396 9 96 61 2 95 6976 50171 699 2 95 8376 50170 197 1 95 7776 50171 599 0 96 0495 70187 395 4 95 4295 70187 396 0 95 6995 70187 095 4 95 72113 2203 995 6 95 39113 2202 995 0 triumbelletin 95 55113 2203 995 7 96 51 7 443 3355 3806 1102 1 443 9355 3805 8101 9 443 6355 3808 3102 6 444 9439 0890 4101 5 442 0439 0884 4100 8 443 3439 0893 2102 5 443 4526 3968 499 8 441 9526 3964 899 4 daphnoretin 442 6526 3972 6100 7 101 31 1 可编辑修改 表表 2 22 2 不同产地了哥王中不同产地了哥王中 4 4 种香豆素的含量测定结果种香豆素的含量测定结果 Table 2 2Table 2 2 ContentsContents ofof thethe fourfour coumarinscoumarins inin WikstroemiaWikstroemia indicaindica L C A Mey L C A Mey collectedcollected fromfrom differentdifferent regionsregions n n 3 3 umbelliferone daphnoretin 7 O D glucoside triumbelletindaphnoretin Content RSD Content RSD Content RSDContent RSD NO Sample g g 1 g g 1 g g 1 g g 1 1Yunnan15 8431 823 371 8 1 7889 01 5 2Yunnan215 551 9235 31 7169 31 615161 5 3Guangxi110 801 644 002 0272 00 612601 4 4Guangxi26 1972 067 791 7351 71 215720 7 5Guangxi310 281 2183 81 7 2 214621 7 6Sichuan6 5280 722 401 1170 82 1744 41 9 7Jiangxi9 5470 838 601 0426 70 810580 9 8Hunan11 262 025 601 7234 61 314761 6 9Guizhou16 852 0 35 50 1 2 1 817291 9 Means not detected 可编辑修改 第三章 结论与讨论 3 3 1 1 结结论论 该方法简便 准确 重复性好 适用于中药了哥王的质量控制 经测定发现各产地了哥 王药材含量差异较大 可能受地域环境或气候影响所致 3 3 2 2 讨论讨论 a 分别取适宜浓度的 4 种香豆素的对照品溶液在 200 400 nm 波长作紫外扫描 结果在 345 nm 下 4 个香豆素有共同的较大紫外吸收 且作 HPLC 检测时 该波长下干扰小 待测组 分达到基线分离 重现性良好 故本实验中吸收波长选用 345 nm b 考察甲醇 水 乙腈 水 甲醇 0 1 磷酸水溶液 乙腈 0 1 磷酸水溶液 乙腈 0 1 冰醋酸水溶液等流动相系统 结果显示以乙腈 0 1 磷酸水溶液为流动相时分离度及峰形能 达到较好效果 同时在流动相中加入四氢呋喃 并未明显改善分离效果 故确定以乙腈 0 1 磷 酸水溶液为流动相系统进行梯度洗脱 c 分别考察了乙醇 体积分数为 25 50 75 80 90 的甲醇 甲醇作为提取溶 剂 采用超声提取法提取了哥王中的 4 种香豆素 结果表明乙醇提取待测物的色谱峰干扰较 严重 本底较高 故不予采用 体积分数为 80 的甲醇提取待测成分的含量均较高 故采用 体积分数为 80 的甲醇为提取溶剂 以体积分数为 80 的甲醇为提取溶剂比较加热回流提取 法和超声提取法 结果超声提取法的提取率较高 以体积分数为 80 的甲醇为提取溶剂 超 声处理 30 45 60 min 结果表明超声处理 45 min 样品中的待测成分已基本提取完全 综 合考虑提取量和色谱峰的干扰情况 故本研究采用体积分数为 80 的甲醇超声处理 45 min 提取方法 d 样品测定实验结果 了哥王中 triumbelletin 和西瑞香素含量明显高于伞型花内酯 和西瑞香素 7 O D 葡萄糖苷 不同产地的了哥王中伞形花内酯和西瑞香素含量差异较小 而西瑞香素 7 O D 葡萄糖苷和 triumbelletin 含量差异较大 其中云南产地 NO 2 的西 瑞香素 7 O D 葡萄糖苷含量最高 四川产地 NO 6 的西瑞香素 7 O D 葡萄糖苷含量 最低 江西产地 NO 7 的 triumbelletin 含量最高 而云南产地 NO 1 广西产地 NO 5 和 贵州产地 NO 9 未测到 triumbelletin 本文与参考文献 18 20 对比 了哥王中伞形花内酯 和西瑞香素的平均含量分别降低约 10 倍和 3 倍 说明不同的生长环境 温度 湿度等因素 都对了哥王中这 2 种成分的含量有影响 可编辑修改 参考文献 1 宋小妹 等 中药化学成分提取分离与制备 M 北京 人民卫生出版社 2004 48 50 2 何建芳 等 了哥王研究进展 J 浙江中西医结合杂志 2001 11 2 129 132 3 耿立冬 等 了哥王化学成分研究 J 中国中药杂志 2006 31 10 817 819 4 耿立冬 等 了哥王中的 1 个新双香豆素 J 中国中药杂志 2006 31 1 43 45 5 卢艳花 中药有效成分提取分离技术 J 化学工业出版社 2006 215 218 6 Gonzalez Aragon D Ariza J Villalba J M Dicoumarol impairs mitochondrial electron transport and pyrimidine biosynthesis in human myeloid leukemia HL 60 cells J Biochemical Pharmacology 2007 73 427 439 7 Kostova I Momekov G New cerium III complexes of coumarins synthesis characterization and cytotoxicity evaluation J European Journal of Medicinal Chemistry 2008 43 178 188 8 Tsai W J Chen Y C Wu M H et al Seselin from Plumbago zeylanica inhibits phytohemagglutinin PHA stimulated cell proliferation in human peripheral blood mononuclear cells J Journal of Ethnopharmacology 2008 119 1 67 73 9 Dongmo A B Azebaze A