实验--基因结构预测分析.doc

学院：_ 班级:_ 学号:_ 姓名:_ 成绩：_实验五 基因结构预测分析目的：1、熟悉并掌握从基因组核酸序列中发现基因的方法。内容：1、用NCBI的ORF Finder分析原核生物核酸序列或真核生物的cDNA序列中的开放阅读框；2、使用GENSCAN在线软件预测真核生物基因；3、使用POLYAH在线预测转录终止信号；4、使用PromoterScan在线预测启动子区域。操作及问题：随着测序技术的不断发展，越来越多的模式生物启动了全基因组测序计划，完成全基因组测序的物种也越来越多，使得基因结构和功能的预测成为可能。同时，通过基因组文库筛选也可得到目的基因所在克隆。获得克隆序列后，同样也需要对目的基因做结构预测以便指导后续功能研究。本实验介绍几种常用的基因预测分析工具，预测核酸序列的开放阅读框、转录终止信号、启动子、CpG岛等信息。一、开放阅读框（open reading frame，ORF）的识别ORF是指从核酸序列上5端翻译起始密码子到终止密码子的蛋白质编码序列。原核生物与真核生物的基因结构存在很大不同，真核生物的ORF除外显子（平均150bp）外，还含有内含子，因此真核生物基因的预测远比原核生物复杂。（一）利用 NCBI ORF Finder预测原核生物核酸序列或真核生物的cDNA序列中的开放阅读框。/gorf/gorf.html1、在NCBI上查找 AC 号为 AE008569 的核酸记录。（见实验五中的AE008569.mht）问题1：这个序列的名称？问题2：这个序列来源物种所属的生物学大分类？ 2、进入OFR Finder，首先在页面下方的Genetic codes下拉菜单中浏览现有的 22 种遗传密码选择项（这里我们只使用默认的standard code），利用 AC 号或其raw sequence（即不带任何注释信息的全序列）进行 ORF finding。（ 预测结果见实验五文件夹中AE008569 ORF Finder.mht）3、在结果显示页面中，按照序列的正向+1、+2、+3 以及反向的1、2、3 进行的六框翻译结果以图形的方式显示在页面中。利用默认的100bp阈值所发现的各框内的ORF以绿色条状显示。同时，按照六框内所有发现的 ORF 的大小顺序，在页面的右侧有一个列表，分别显示了 ORF 的翻译框在核酸序列上的位置以及 ORF 的长度。你可以改变 ORF 鉴别中的长度阈值（50，100，300），点击 Redraw 重新进行计算。 4、点击图形上的绿色条框，就可以对这个 ORF 进行检查（当然也可以点击右侧的 ORF 列表），页面上会显示预测的氨基酸序列，同时页面上还嵌入了BLAST 程序以及 NCBI 的有关序列数据库以便于发现与此 ORF 相似的库记录。5、SixFrames 是以另外一种方法计算并显示结果，点击 SixFrames，结果中各框上边拉下的绿色短线表示为一个起始密码子，而各框下方的粉色短线表示为一个终止密码子。 6、如果你拥有一个高等生物的 cDNA 时，可以利用 ORF finder 这个简单的工具来找到你的蛋白编码区域。因为 cDNA 不含有 intron，因此可拥有与微生物相似的 ORF 结构。 根据以上预测结果回答问题3：问题3：该条序列中最长的ORF是多长？编码多少氨基酸？位于序列中的什么位置？ （二）使用GENSCAN在线软件预测真核生物基因 GENSCAN（/GENSCAN.html）软件由斯坦福大学的Chris Burge开发，它是针对基因组DNA序列预测ORF及基因结构信息的开放式在线资源，尤其适用于脊椎动物、拟南芥和玉米等真核生物。这里以提交一个AC号为AC002390的人类cosmid序列为例，进入GENSCAN页面，先选择物种脊椎动物（vertebrate），上传序列文件或直接粘贴序列，运行后，从返回结果中可获得所预测到的基因数目、外显子数目和类型，预测单元的长度、方向、位置及相位、编码区打分值、可信概率、总的分值等信息。（结果见实验五文件夹中AC002390 GENSCAN Output.htm）根据结果回答问题：问题4：经预测，该序列中可能有几个基因？是否完整？问题5：预测到的第一个基因的编码区由几个外显子组成？起始外显子的位置在什么区域？二、CpG岛的预测分析CpG岛（CgG island）是指一段200bp或更长的DNA序列，核苷酸G+C的含量较高，并且CpG双核苷酸出现频率占G+C含量的50%以上，其中“P”表示“C”和“G”以磷酸二酯键连接。有6080的人类基因的启动子和起始外显子附近存在CpG岛，因此搜寻cpG岛可以为基因及其启动子预测提供重要线索。这里介绍CpGPlot这个EMBL-EBI中心开发的网上在线预测CpG岛工具。我们仍以上述AC002390这个人类cosmid序列作为CpGPlot的预测对象。进入CpGPlot页面（http:/www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/index.html），上传序列文件或直接粘贴序列并采用默认参数，完成提交任务。（结果见实验五文件夹AC002390 CpGPlot.mht文件）运行（Run）后，CpGPlot将以CpGplotPNG格式返回3个图示结果：序列各个位置（G+C）含量观察值/期望值（Obs/Exp）的比率；序列各个位置的（G+C）；CpG出现频率高于阈值的位置。同时以Cpgplot output输出文本，告知提交序列AC002390全长70311，各个位置（G+C）含量Obs/Exp比率0.60，（G+C）50.0；两个CpG岛长度及起始、终止位置。问题6：在该序列中预测到几个CpG岛？分别位于序列的什么区域？参照GENSCAN的预测结果发现，前一个CpG岛位置正好和基因起始外显子区域对应；而后一个CpG岛出现在启动子区域上游2 kb左右的区域，并没有基因对应关系，这可能是GENSCAN对基因位置的错误预测所致。由此说明，基因及启动子预测尚需要来自其他分析的证据。三、转录终止信号的预测分析真核生物编码基因中，转录终止信号是在mRNA序列的3端终止密码子下游位置上的加尾信号（tailing signal），其主要标志为AATAAA序列，称为多聚腺苷酸信号（polyadenylation signal），简称polyA信号序列。搜索polyA序列有助于基因终止位点的预测。这里介绍在线工具POLYAH，它可以识别3端剪切和polyA区域。进入POLYAH页面（/berry.phtml?topic=polyah&group=programs&subgroup=promoter），用Fasta格式上传AC002390序列文件或直接粘贴序列传交（PROCESS）后，网页返回结果列出了该序列所有50个可能的polyA位点的位置（Pos.）和权重（LDF）。例如，在52 398碱基处有polyA信号，权重为2.54。注意：真核生物基因组序列本身存在大量的重复序列，当以polyA位点预测基因终止信号位点时会出现较大比例的假阳性。问题7：终止信号预测结果与GENSCAN软件的预测结果是否一致？有何不同？四、启动子区域的预测分析启动子是一段位于结构基因5端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地结合并引导转录的起始。启动子决定了DNA转录的方向、速度和准确性。本实验借助PromoterScan工具来预测AC002390序列的启动子区域。进入PromoterScan页面（/molbio/proscan/），粘贴序列后不需要设置任何参数。（结果见实验五文件夹中AC002390 proscan.htm文件）PromoterScan以单元的形式列出所有可能的启动子区域，给出可能的转录因子名字，Ghosh TFD da