2019-2020学年高中生物 第一章 无菌操作技术实践 第一节 微生物的分离和培养 第2课时 微生物分离和培养的技术操作（以大肠杆菌为例）学案 苏教版选修1.doc

第2课时微生物分离和培养的技术操作(以大肠杆菌为例)学习导航明目标、知重点难点 了解培养基的配制过程及培养基的配制原则。(重点) 掌握无菌操作和接种技术。(重、难点) 学生用书p9阅读教材p1014分析大肠杆菌的接种与分离培养1配制牛肉膏蛋白胨培养基2斜面接种和培养大肠杆菌斜面接种大肠杆菌的主要目的有菌种转移、扩大培养和保存纯净菌种等。具体操作步骤：3平板划线分离和培养大肠杆菌在实验室中，平板常常被用来培养、分离细菌等微生物。(1)牛肉膏蛋白胨固体培养基的平板制作配制好的培养基装瓶灭菌倒平板操作(a.打开瓶塞b.灼烧瓶口灭菌c.倒培养基d.倒置平板)(2)平板划线分离与培养大肠杆菌平板划线法的含义：用带有微生物的接种环在平板培养基表面通过分区划线而纯化分离微生物的一种方法。注意事项：接种和划线操作时需要在酒精灯火焰附近进行。培养结果：可以得到由单个细菌增殖而形成的菌落。 判一判(1)锥形瓶的瓶口通过火焰灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。()(2)平板冷凝后，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。()(3)制备细菌培养基的操作顺序为配制培养液、调节ph、灭菌、分装。()(4)使用已灭菌的接种环、培养基，操作过程中不再灭菌。() 连一连培养基的配制学生用书p10利用培养基培养微生物首先要把微生物接种到培养基上，在实验室中，平板常常被用来培养、分离细菌等微生物。结合教材p1014内容完成以下探究。 探究1下表是牛肉膏蛋白胨固体培养基的成分，请说出各成分提供的营养培养基组分提供的主要营养物质牛肉膏5.0 g碳源、氮源、磷酸盐和维生素蛋白胨10.0 g碳源、氮源和维生素nacl 5.0 g无机盐h2o定容至1 000 ml氢元素、氧元素 探究2完善下面牛肉膏蛋白胨培养基的配制步骤，学会培养基的配制配制培养基调节ph至7.2分装：培养基的高度约为试管长度的1/5包扎灭菌：高压蒸汽灭菌是常用的灭菌方法之一搁置斜面：待试管冷却至50_左右，斜面长度不超过试管总长的1/21培养基的配制原则(1)目的明确：不同微生物需求不同，根据培养目的进行配制。(2)营养要协调：营养物质的浓度和比例要适宜。(3)ph要适宜：为维持ph的相对恒定，可在培养基中加入缓冲剂，常用磷酸氢二钾或磷酸二氢钾。2培养基配制中的注意事项(1)用天平称量时，注意放等大的称量纸。(2)培养基熔化中的注意事项在琼脂熔化时要不断用玻璃棒搅拌，防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。熔化后需要先调节ph，再分装，后灭菌。(3)培养基倒平板时的注意事项培养基灭菌后要冷却到50 左右时开始倒平板。其原因是琼脂是一种多糖，在98 以上熔化，在44 以下凝固，倒平板时高于50 会烫手，低于50 时，若不能及时操作，琼脂会凝固。倒平板时，要使锥形瓶的瓶口通过火焰。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。倒平板整个过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。平板冷凝后，要将平板倒置。因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，培养基表面的温度也较高，平板倒置后，既可使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，那么这个平板不能用来培养微生物，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。1下列有关培养基配制原则的表述，正确的是()a任何培养基都必须含有碳源、氮源、矿质元素、水及生长因子b碳源和氮源必须具有一定比例，碳元素的含量最多，其次为氮元素c微生物的生长除受营养因素影响外，还受到ph、氧气、渗透压的影响d营养物质的浓度越高越好解析：选c。培养基中一般含有碳源、氮源、无机盐和水等，有些培养基中还需加入生长因子。培养基中的碳源和氮源要有一定的比例，并不一定碳元素含量最多。营养物质浓度过高会导致微生物失水死亡。2下列关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的叙述，错误的是( )a操作顺序为计算、称量、熔化、搁置斜面、灭菌b将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯c待培养基冷却至50 左右时进行搁置斜面d斜面培养基形成的斜面的长度不超过试管总长的1/2答案：a大肠杆菌的接种学生用书p11观察下图接种操作程序，学会斜面接种和培养大肠杆菌。准备接种：用一只手的大拇指和其他四指夹住菌种试管，管口并齐，管内培养基斜面向上接种环灭菌：手持接种环，将接种环的环端和接种时可能进入试管内的部分放在酒精灯火焰上，来回灼烧多次，以达到迅速彻底灭菌的目的试管口灭菌：在火焰边用握有接种环的手的小指、无名指、中指和掌心拔去两支试管上的试管塞，迅速将试管口通过火焰23次，以杀灭试管口上的微生物挑取少量菌种：将接种环伸入有菌种的试管内，让环部先接触培养基斜面顶端或其他无菌的部位使其冷却。然后，轻轻挑取少许菌种，在抽出接种环时，其带菌部位不要触及试管壁，也不要通过火焰处划线接种：将上述带菌的接种环伸入待接种的试管中，在培养基斜面上由底部向上轻轻划“s”型曲线。注意划曲线时不要将培养基表面划破抽出接种环：将试管口和试管塞分别通过火焰23次，迅速塞紧试管。多次灼烧接种环确保无菌，冷却后，放回原处培养：将接种过菌种的试管放在恒温箱中(37 )培养24 h，观察接种和培养的结果保存菌种：将增殖的菌种放置在冰箱冷藏室中(4 )保存1接种成功的标准如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，实验失败，需要分析原因，再次接种。2接种时的几个注意事项(1)接种过程需要两支试管：一支试管含有菌种，另一支试管含有培养基，用于接种；(2)接种过程中为杀灭试管口上沾染的微生物要对试管口进行灭菌；(3)带菌的接种环抽出试管时带菌部分不可触及试管壁；(4)接种划线时不要将培养基的表面划破。1下列关于接种操作过程的叙述，不正确的是()a要将接种环灼烧灭菌b取下棉塞后要将试管口灼烧灭菌c将接种环伸入试管内，先接触长菌多的部位d接种后还要将管口灭菌加塞解析：选c。接种环伸入试管内后先接触未长菌的部位，待接种环冷却后再接触长菌部位。2下列关于接种微生物的叙述，错误的是()a用玻璃涂布器进行涂布平板接种b用接种针进行穿刺接种c常用接种工具有玻璃涂布器、接种环等d使用接种工具时不用灭菌答案：d大肠杆菌的分离和培养学生用书p12完善下面示意图，学会分离和培养大肠杆菌。1平板划线法的类型：有扇形划线、连续划线、交叉划线、方格划线等(如下图)。2平板划线操作的注意事项(1)第一次划线及每次划线之前都需要灼烧接种环，划线结束后仍需灼烧接种环，三次灼烧的目的不同。项目目的第一次划线前灼烧避免接种环上可能存在的微生物污染培养物每次划线前灼烧杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使每次划线的菌种均来自上次划线末端划线结束灼烧杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者(2)灼烧接种环之后，要待其冷却后才能伸入菌液中，以免温度太高杀死菌种。(3)除第一次划线外，每次划线都从上一次划线的末端开始，这样能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。(4)划线用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破。1斜面培养基正确的划线示意图是()解析：选a。正确的接种方法是将带菌的接种环伸入待接种的试管中，在培养基表面上由底部向上轻划“s”型曲线，将菌种接种到培养基上。2下列有关平板划线操作的叙述，不正确的是()a第一次操作前灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物b每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种c在第二区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于菌液d划线结束后，灼烧接种环能及时杀死接种环上的菌种，避免细菌污染环境或感染操作者解析：选c。平板划线法通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面，以形成单菌落。因此，每次划线时，都应将接种环上原有的菌体杀死，划线时分散的菌体来自上次划线结束时的菌体。核心知识小结网络构建关键语句 在无菌条件下将微生物接入培养基的操作过程叫做接种。 细菌培养基的配制过程：配制培养基调节ph分装包扎灭菌搁置斜面。随堂检测 学生用书p13 知识点一培养基的配制1在培养基的配制过程中，具有如下步骤，其正确顺序为()熔化调ph加棉塞包扎分装称量abcd解析：选b。上述步骤中，培养基的配制顺序为称量熔化调ph分装加棉塞包扎。2牛肉膏蛋白胨培养基中加入琼脂这一理想的凝固剂，下列关于琼脂的说法，不正确的是()a不被所培养的微生物分解利用，对所培养的微生物无毒害作用b在微生物生长温度范围内保持固体状态c琼脂凝固点低，利于微生物的生长d琼脂在灭菌过程中不会被破坏，透明度好，凝固力强解析：选c。在液体培养基中加入凝固剂如琼脂后，制成固体培养基，它是实验室中最常用的培养基之一。固体培养基中可形成肉眼可见的单个细胞繁殖而来的子细胞群体，即菌落，用于微生物的分离、计数和菌种鉴定等。琼脂作为一种理想的凝固剂，是其性质决定琼脂不会被微生物利用且对微生物无毒害作用，在灭菌过程中不会被破坏，透明度好，凝固力强。琼脂在98 以上可溶解于水，在45 以下凝固，所以在微生物生长温度范围内保持固体状态。 知识点二无菌操作和接种技术3做“微生物的分离与培养”实验时，下列叙述正确的是()a高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖b倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上c为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落d用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上解析：选d。a项，在高压灭菌的操作过程中，加热结束后应让灭菌锅内温度自然下降，待压力表的压力降到零时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子。b项，倒平板时，用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，而不是完全取下放到一边。c项，接种环经火焰灼烧灭菌后应在火焰旁冷却后再挑取菌落。d项，在微生物的培养中，一般将培养皿倒置，在皿底上用记号笔做标记。4下图为实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤，下列说法错误的是()a步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行b步骤中待倒入的培养基冷却后盖上培养皿的皿盖c步骤中，每次划线前后都需对接种环进行灭菌处理d划线接种结束后，将图平板倒置后放入培养箱中培养解析：选b。由图可知，是倒平板，是用接种环沾取菌液，是进行平板划线，是培养。步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行，防止被杂菌污染，a正确；倒完平板后立即盖上培养皿，冷却后将平板倒过来放置，b错误；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落，c正确；划线接种结束后，将平板倒置后放入培养箱中培养，有利于表面的水分更好的挥发和防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染，d正确。5如图是微生物平板划线示意图。划线的顺序为12345。下列操作方法正确的是()a操作前要将接种环放在火焰边灼烧灭菌b划线操作应在火焰上进行c在5区域中才可以得到所需菌落d在1、2、3、4、5区域中划线前后都要对接种环灭菌解析：选d。在每次划线前后都要对接种环进行灭菌，接种环的灭菌方法应是在火焰上灼烧，接种时划线操作是在火焰旁进行。在5个区域中，只要有单个活细菌，通过培养即可获得所需菌落。6“创卫”是创建卫生城市的简称。“卫生城市”是一个城市综合功能和文明程度的重要标志。某同学欲利用所学习的微生物培养知识，通过实验证明痰液中含有细菌，来倡导同学们不要随地吐痰，为 “创卫”添一份力。请回答下列问题： (1)欲培养细菌必须先制备可供细菌生长的培养基。实验室中常用牛肉膏蛋白胨固体培养基来培养微生物，该培养基的组成成分包括牛肉膏、蛋白胨、nacl、_、h2o等；该培养基中微生物所需的氮源来自_；制备该培养基的步骤是：配制培养基调节ph分装包扎灭菌倒平板，其中灭菌常用的方法是_；培养基灭菌后，需要冷却到_左右才能倒平板，等平板冷凝后，还需要将平板倒置，主要目的是_。 (2)为了使实验更有说服力，该同学设置了空白对照组和若干实验组，其中对照组的作用是_。若在某次调查中，某一实验组平板上的平均菌落数为39个，而空白对照组的平板上出现了9个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了_现象。答案： (1)琼脂牛肉膏、蛋白胨高压蒸汽灭菌法50防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染(2)排除实验组中非测试因素对实验结果的影响(答案合理即可)污染课时作业 学生用书p63(单独成册)一、选择题1下面关于斜面接种大肠杆菌的主要目的，表述错误的是( )a菌种转移b扩大培养c保存纯净菌种d消毒答案：d2下列有关微生物培养的叙述，正确的是( )a培养前均需要对培养基进行高压蒸汽灭菌b均要确保培养基中含有所需的全部营养物质c平板划线法和涂布平板法均可用于鉴定菌种d均需要放在恒温培养箱中通入氧气培养解析：选c。微生物接种前，要对培养基进行高压蒸汽灭菌，a错误；培养基中只需要含有满足微生物生长需要的营养物质，b错误；平板划线法和涂布平板法均可用于鉴定菌种，c正确；有些微生物属于厌氧型，就不需要氧气，d错误。3某研究小组从有机废水中分离微生物用于废水处理。下列叙述正确的是()a培养基分装到培养皿后进行灭菌b转换划线角度后需灼烧接种环再进行划线c接种后的培养皿需放在光照培养箱中培养d培养过程中每隔一周观察一次解析：选b。微生物分离中培养基的制备应是先灭菌再倒平板，a项错误；每一次划线前都要灼烧接种环，以杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，b项正确；接种后的培养皿应在恒温培养箱中进行培养，c项错误；培养过程中观察的间隔时间不能太长，适宜条件下观察一次一般不超过24 h，d项错误。4斜面培养基形成的斜面的长度不超过试管总长的()a1/5b2/3c1/4 d1/2解析：选d。搁置斜面长度不超过试管总长度的1/2。5测定3类细菌对氧的需求，让它们在3个不同的试管中生长，如图显示了细菌的生长层。据此判断：只能在有氧培养基中繁殖、只能在无氧培养基中繁殖、在有氧和无氧的培养基中都能繁殖的细菌依次是()a、 b、c、 d、答案：a6要从多种细菌中分离某种细菌，培养基要用()a加入青霉素的培养基b固体培养基c加入高浓度食盐的培养基d液体培养基解析：选b。如果加入青霉素则抑制大部分细菌生长；若加入高浓度食盐，则只能选择出金黄色葡萄球菌；液体培养基多用于生产，分离鉴定一般不用液体培养基。7下列关于平板划线操作的叙述，错误的是()a每次划线前都要灼烧接种环b灼烧接种环后，要立即用接种环接种，防止杂菌污染接种环c要在酒精灯火焰旁进行d接种前，要将菌种试管口通过火焰解析：选b。灼烧接种环后，将接种环伸入管内，让环端先接触培养基上未长菌的部位，使其冷却，然后轻轻挑取少量菌体，再进行接种。灼烧接种环后，不可立即用接种环接种，以免接种环温度过高，将菌种杀死。8微生物培养是微生物工程中的基础技术。下列相关叙述正确的一项是()a病毒和细菌的培养基成分相同b平板划线法中的划线是连续进行的c微生物培养基中并不都必须添加碳源或氮源d在培养的过程中，细胞种类、数目都不断地增加解析：选c。病毒和细菌的培养基成分有区别。平板划线法中的划线可以是连续的，也可以是间断的。微生物的培养过程中，细胞数目不断增加，细胞的种类不变。9下列关于对大肠杆菌的接种的叙述，不正确的是()a接种环在接种的试管斜面上轻轻划“s”型曲线b在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基、培养皿和接种环进行消毒c不能用刚刚灼烧过的接种环直接挑取菌种d使用过的培养基及其培养物必须经过灭菌处理后才能丢弃解析：选b。灭菌是指采用强烈的物理或化学方法使物体内外所有的微生物永远丧失生长繁殖能力，所以，对培养基、培养皿和接种环进行灭菌而不是消毒；因为灼烧过的接种环温度太高，直接接触菌种会将菌种杀死，所以要将接种环接触没有菌种的培养基的顶端待温度降低后再挑取菌种；有的大肠杆菌会释放一种强烈的毒素，所以使用过的培养基及其培养物必须经过灭菌处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。10如何判断制作的培养基是否灭菌彻底()a看培养基是否透明b有没有消灭细菌菌体c未接种的培养基在恒温箱中保温12天后检验有无菌落生长d是否消灭了微生物的芽孢、孢子解析：选c。配制好的培养基是否灭菌彻底通常在使用前，在恒温箱中保温12天后检验有无菌落生长，若无则说明灭菌彻底。11下列操作属于灭菌的是()a接种前用火焰灼烧接种环b接种前用酒精擦拭双手c将平板倒置，放入培养箱中培养d接种在酒精灯的火焰旁完成解析：选a。要正确区分灭菌、消毒和防止杂菌污染。a项属于灭菌，b项属于消毒，c、d项都是实验操作过程中防止杂菌污染的措施，与灭菌无关。12下列依次表示倒平板、接种的位置，以及划线法接种的路径示意图，其中错误的是()解析：选d。倒平板时，用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖，防止空气中的杂菌污染，故a正确；接种时，左手将培养皿打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，故b正确；划线时要从上一次划线的末端开始进行，让菌种来源于上一次划线末端，故c正确，d错误。二、非选择题13急性肠胃炎、手足口病分别是由细菌、病毒通过消化道进入人体导致的。因此检验饮用水的细菌、病毒的含量是有效监控疾病发生的必要措施。请回答下列与检验饮用水有关的问题：(1)检验大肠杆菌含量时，通常将水样进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的水样用玻璃涂布器分别涂布到固体培养基的表面进行培养，记录菌落数量，这种方法称为_。下图所示的四种菌落分布图中，不可能由该方法得到的是_。(2)用该方法统计样本菌落数量是否需要对照组？_。为什么？_。(3)有三种材料或用具需要消毒或灭菌：培养细菌用的培养基与培养皿；玻璃棒、试管、烧瓶和吸管；实验操作者的双手。其中需要消毒的是_，需要灭菌的是_。(4)已知大肠杆菌能发酵乳糖并产酸产气，现提供足量的已灭菌的乳糖蛋白胨培养液和具塞试管，应如何判断待检水样中是否含有大肠杆菌？_。解析：(1)平板划线法所得菌落集中呈线状，d的菌落分布情况可判断为平板划线法接种。(2)为判断培养基灭菌是否合格，本实验需要对照。(3)消毒是指使用较温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)。灭菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。对人的手不能进行灭菌。(4)根据题意大肠杆菌能产生气体，对培养基进行接种观察有无气泡产生来判断大肠杆菌的有无。答案：(1)涂布平板法d(2)需要因为需要判断培养基是否被杂菌污染(培养基灭菌是否合格)(3)(4)通过无菌操作向试管内注入一定量待测水样。再注入已灭菌的乳糖蛋白胨培养液将试管充满，塞上塞子，混匀后置于37 恒温箱培养24 h。若试管内有气泡生成，则说明水样中有大肠杆菌14炭疽病是由炭疽杆菌引起的一种人畜共患传染病。炭疽杆菌两端截平、呈竹节状排列，菌落呈卷发状。对炭疽病疑似患者，可根据噬菌体的宿主专一性，通过实验确诊。(1)细菌培养：采集疑似患者的样本，分离培养，获得可疑菌落。(2)细菌鉴定：实验流程如图所示对配制的液体培养基等需采取_法灭菌；实验所用液体培养基的碳源为_(填“无机碳”或“有机碳”)。挑选可疑菌落制片后，用_观察，可看到呈竹节状排列的杆菌。接种可疑菌后，35 培养24小时，液体培养基变浑浊，原因是_。对照组试管中应加入_，与实验组同时培养6小时后，若实验组液体培养基的浑浊度比对照组_(填“高”或“低”)，则可明确疑似患者被炭疽杆菌感染，反之则排除。解析：(2)培养可疑炭疽杆菌之前应先将液体培养基进行高压蒸汽灭菌。由于炭疽杆菌是异养生物，因此培养基中的碳源应是有机碳。观察细菌应用显微镜。接种可疑菌24小时后，液体培养基变浑浊的原因是细菌大量繁殖。答案：(2)高压蒸汽灭菌有机碳显微镜细菌大量繁殖等量生理盐水低15某化工厂的污水池中含有一种有害的难以降解的有机化合物a。研究人员用化合物a、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，成功筛选到能高效降解化合物a的细菌(目的菌)。实验的主要步骤如图所示。请分析回答下列问题：(1)培养基中加入化合物a的目的是_，这种培养基属于_培养基。(2)“目的菌