农药残留检测与样品前处理技术的发展趋势(1).doc

农药残留检测与样品前处理技术的发展趋势一、 概述农药是当前农业生产用于防治病、虫、杂草对农作物危害不可缺少的物质，对促进农业增产有极重要的作用。随着农业科学技术的发展，化学农药的品种和数量不断增加，已成为防治病虫害的主要手段。农药施用到农作物上以后，绝大部分因多种原因而转化，但作物内会残留有极少量的农药。长时间摄食残留农药会影响人体的健康，这就是农药残留量问题的由来。近年来，在茶叶、粮谷、蔬菜及水果种植中由于不少农户忽视农药的正确、合理使用，农药污染问题经常发生，农药残留量超标相当严重，并逐年加剧。而欧盟、美国、日本、加拿大等西方发达国家或地区，出于维护本国经济利益和保护人们健康的需要，相继对进口食品中农药残留量等卫生指标提出了愈来愈严格的要求。鉴于此，为保障我国人民的身体健康、有效控制农药在茶叶、粮谷、蔬菜和水果等生产中的合理使用和对其残留量进行监控，满足进出口贸易的需要，大力开展农药残留量检测技术以及相关的前处理技术的研究是非常必要的。化学农药是一类复杂的有机化合物，根据其用途可以分为杀虫剂、杀菌剂、除草剂、植物生长调节剂、杀螨剂、杀鼠剂、杀线虫剂。根据化学结构又可分为有机氯、有机磷、拟除虫菊酯杀虫剂，取代氯苯氧基酸或酯除草剂，氨基甲酸酯杀虫剂、除草剂和杀菌剂和有机杂环类杀菌剂、除草剂等。农药残留量分析需要测定各种样品中ug/g、ng/g、甚至pg/g量级的农药和/或代谢产物及降解产物。其分析过程一般包括取样、样品处理（提取、净化和衍生化）和测量，根据农药种类和样品基质的不同，上述各个步骤的复杂性有所不同。色谱方法常用于样品的净化和测量，以前较多采用填充柱气相色谱法（GC），现在则越来越多地使用毛细管气相色谱法（GC）和高效液相色谱法（HPLC），尤其在定性分析的气相色谱/质谱法（GC/MS）中，毛细管柱技术占绝对优势。电子捕获检测器（ECD）、火焰光度检测器（FPD）、氮磷检测器（NPD）是最常用的农药残留量分析的气相色谱检测器，质谱检测器（MSD）则是最通用和灵敏的检测器。各种进样方式，如分流、不分流、冷柱上进样技术和程序升温汽化进样技术都已应用于农药残留物分析。近年来，随着农药残留研究的不断深入，农药残留检测方法日趋完善，并向简单、快速、灵敏、多残留、低成本、易推广的方向发展。在检测技术方面，目前国际上已较多采用多残留检测技术和快速筛选检测技术传统的农残分析大多用来分析某一类农药的单一成分，多残留分析方法（Multi-ResidueAnalysis Method）不仅可以用于分析同一类农药中的不同成分，而且可以分析不同种类农药中的不同成分。前者称为选择性多残留分析方法（Selective Multi-Residue AnalysisMethod），后者称为多类多残留分析方法（Multi-class,Multi-Residue Analysis Method）。这方面，如英国中央科学实验室（CSL）开发了104 种农药残留量同时检测的方法；德国科学研究协会开发了320种农药残留的多残留检测方法；美国FDA农药分析手册（PAM）的多残留方法可检测300 多种农药；美国CDFA 和荷兰卫生部都有较好的多残留同时检测方法和系统分析方法。这些方法，既可用于定量，又可进行确证。我国从上世纪90年代初开始研究和利用多残留分析方法，并相继推出了一系列国家标准。如国家标准GB/T17331-1998食品中有机磷和氨基甲酸酯类农药多种残留的测定和GB/T17332-1998 食品中有机氯和拟除虫菊酯类农药残留的测定等，均可同时测定不同类型中的20多种农药残留。在我们的行业标准中SN/T0334-95多残留检测方法能同时检测22 种农药残留量，秦皇岛局制定的农产品中多种拟除虫菊酯残留量检验方法已成为国际AOAC方法。在我局技术中心目前开发或采用的检测茶叶、蔬菜等样品中有机氯、有机磷、菊酯类农药以及一些杂环类农药的方法和本次研讨会将要学习和讨论的方法也大都是多残留检测方法。当然，我们现在的方法，在一次性检测农药的数量上和确证技术上与国际先进方法还存在不小的距离。在快速筛选检测技术方面，上个世纪六十年代就有人利用薄层色谱酶抑制法测定有机磷农药等残留量，检测限量为毫克级；八十年代开始，农药的酶抑制和免疫检测技术作为快速筛选检测方法受到许多发达国家的高度重视，并因此得到了快速发展。酶抑制、酶联免疫（ELISA）、放射免疫（RIA）、单克降抗体等技术由于可以避免假阴性，适宜于阳性率较低的大量样品检测，在农兽药残留检测中应用日益增多。我国在近十多年来也相继开展了农药残留酶抑制法和免疫法快速筛选检测方法研究，取得了一定的研究成果，系统内有广东检验检疫局研制了农药残留速测卡，但总体上应用不多，方法的灵敏度不高，试剂不够稳定。在样品前处理方面，现代色谱分析样品制备技术的发展趋势就是使处理样品的过程要简单、处理速度快、使用装置要小、引进的误差要小、对欲测定组分的选择性和回收率要高目前，国际上较多使用固相萃取(SPE)、微波提取技术、凝胶层析(GPC)、加速溶剂提取（ASE）、基体分散固相萃取（MSPD）、超临界萃取（SFE）、固相微萃取技术。而我国目前主要采用传统的溶剂萃取，液液分配，柱层析净化，前处理方法自动化程度低、提取净化的效率不高，速度慢，环境污染严重。新开发的前处理技术其目的和结果就是要实现快速、有效、简单和自动化地完成分析样品制备过程。下面就农药残留检测中采用的气相色谱检测技术和前处理技术的新发展向各位做一些简单的介绍。二、检测技术1、GC/MS 和GC/MS/MS技术质谱技术问世于1910年。传统的有四极质谱仪和飞行质谱仪。近年来又出现了串联质谱仪（MS/MS）傅里叶变换离子回旋共振质谱仪等。目前，GC/MS的发展方向是小型化（即台式GC/MS）、自动化（仪器调试、控制、数据处理）、高灵敏度和高稳定性。目前几种常见的离子源有电子轰击型离子源（EI）、化学电离源（CI源）、快原子轰击电离源（FAB源）、解析化学电离源（DCI）、大气压电离源（API 源）等。电子轰击型离子源（EI）是有机质谱应用最广的常规型离子源；化学电离源（CI源）又称软电离技术，可获得准分子离子峰，是EI源的一个补充；大气压电离源（API源）主要用作液相色谱-质谱联用。（1）GC/MS技术气相色谱测定农药残留的基本原理是根据保留时间来判定待测组分。往往因为样品提取和净化等原因，可能会出现许多杂质峰。如果待测组分在保留时间内有一种或多种杂质峰出现，就可能被认为是待测组分，造成误判。GC/MS法不仅根据样品中待测组分在图谱上的保留时间，更主要是根据在此保留时间内残留农药裂解的特征离子碎片，由质谱仪按其分子量和分子结构对农药准确定性，并以此作为定量的依据，从而克服了由于未净化掉的杂质峰与农药保留时间重叠而造成将杂质峰误判为农药的缺点。GC/MS技术在农药残留检测中已有许多成功的应用实例，在此不多作介绍。但随着农药残留限量要求的进一步提高，以及样品基质的影响，这种技术的应用也受到了一定的限制。大家切记，GC/MS方法的灵敏度不是由标准溶液的信噪比提供的，而是由样品基质条件下的信噪比决定的。（2）GC/MS/MS技术比一级质谱具有优势的是以离子阱为质量分析器的离子阱串联质谱仪具有与大质谱相当的功能，可提高灵敏度，可对复杂基体中微量待测物进行测定，对一级质谱无法区分的化合物可进行进一步的确认，以及同分异构体的区分。在分析领域，离子阱串联质谱已成为今后台式小型GC/MS 的发展方向之一。有机磷农药在各种农作物和环境样品中含量很低，目前利用GC/MS技术分析农作物和环境样品中的农药残留量越来越普遍，因为它能给出化合物的结构信息，有利于化合物的定性。但因一般样品中（如蔬菜、水果、茶叶等）的背景干扰较大，导致样品预处理的周期较长，而且回收率较难保证。而MS/MS技术的应用，为复杂样品中微量农药的定性、定量分析提供了新的途径。在分析韭菜中倍硫磷农药时，分别采用EI全扫描和MS/MS分析，在MS/MS 分析条件下，倍硫磷的信噪比相对于EI 全扫描时提高了100 多倍。此外，利用MS/MS 分析的另一大特点是可以将在色谱上不能完全分开的共流出物利用时间编程和多通道检测将其分开。目前，GC/MS/MS 已在环境分析、食品分析等方面得到广泛的应用。该技术不仅适用于复杂基体混合物的定性分析，而且可以利用得到二级质谱结果进行定量。这是因为在两个前后串联的质谱/质谱仪中，前级质谱主要用于担任分离工作，在样品被电离后，它只允许被分析的目标化合物的母离子或特征离子碎片通过，经过碰撞裂解后，再由第二级质谱分析裂解后产生的离子碎片，利用MS/MS可以同时得到较低的检测限和良好的结构鉴定信息（1 个母离子和2 个或更多的的子离子）。与气相色谱检测器相比，传统的台式质谱仪（GC/MS）因灵敏度较低，其使用受到限制。而据文献报道，GC/MS/MS可在与传统气相色谱检测器相似的灵敏度下进行定性定量分析。原因是MS/MS在对离子检测前就排除了干扰，所以即使对复杂样本也可达到很高的灵敏度。它不需要重复进样就能定性，比选择性检测器有更高的可信性。在用传统的质谱仪分析较“脏”的样品时，因大量干扰的存在而不选择低于100amu的离子。因为许多样本的共存杂质含质量数低于100amu的离子；对检测器造成严重干扰，使被测物的碎片离子无法检出。在MS/MS中，子离子图谱中只有来自母离子的碎片离子，因此，低质量离子不受干扰，对结构鉴定更加有用。例如，建立乙酰甲胺磷分析方法时，即使质量数低至M/Z42，该离子由于不受干扰仍可作为定量分析离子。检测技术的发展已对残留量分析提出了更高的要求，即虽然传统中GC 检测器可进行痕量分析并达到较低的检测限，但仍要求用MS 作结构确证。因此任何实验室测定残留量的能力都会受到MS 方法灵敏度的限制。选择离子检测（SIM）已被用于降低检测限。但是，SIM 所收集的离子信息并不如全扫描丰富，不能认为是一个等同的结构分析。在大多数情况下，MS/MS的灵敏度相当于或低于GC选择性检测器的下限，并可在此水平上进行定量分析和真实的分子结构确证。美国纽约州农业署食品实验室已建立了一种用GC/MS/MS技术对水果、蔬菜和牛奶中100 多种农药残留量进行检测、定量和结构确证的方法。这一方法可对浓度范围低至PPB 水平的100 多种农药进行准确的检测和鉴定。美国农业部的Beltsville农业研究中心利用GC/MS/MS技术分析了水果和蔬菜萃取物中22种农药残留物，得到良好的回收率和重现性，检出限小于2ng/g。当然，当前GC/MS/MS 方法的局限性在于仅能检测目标分析物，很难一次进样分析大量化合物。王焕龙等报道了茶叶中有机氯农药残留量的气相色谱/串联质谱分析的研究报告，采用气相色谱串联质谱仪（GC/MS/MS）同时检测茶叶中51种有机氯农药。茶叶样品经二氯甲烷/水匀浆提取，用饱和氯化钠溶液分离水溶性色素杂质，再以弗罗里硅土（硅酸镁）固相萃取柱（SPE）净化，最后以GC/MS/MS检测分析，得到清晰的MS/MS质谱图，可去除茶叶背景值干扰，增加信噪比（S/N），适用于鉴定、确认分析极低浓度的定量分析。茶叶中色素相当多，样品经弗罗里硅土固相萃取柱（SPE）净化后，仍有色素杂质存在，会影响传统的GC/ECD 分析，测定结果经常需要进一步用GC/MS或GC/MS/MS做确证分析，如待测物浓度极低时，茶叶色素的背景值会干扰MS全扫描质谱图做对比分析。而以GC/MS/MS进行分析时，分析物经第一级MS电子轰击后，选择主要母离子或特征离子，以适当碰撞诱导解离（CID）能量做第二次MS电子轰击，产生清晰的MS/MS质谱图，大幅增加信噪比，可做低浓度确证分析。在该方法中，51种分析物可同时进入GC，通过非极性毛细管柱（如HP5-MS柱）分离，再进入MS做定性定量分析，其定量分析结果得到校正线性范围为0.055.0ug/ml，检测极限范围为0.0010.2ug/ml(依据不同分析物而定)。在0.25、0.75及2.5ug/g 添加量回收率中，得到平均回收率为70120%之间。在实际茶叶样品试验中，经GC/ECD 检测为阳性的样品，以GC/MS/MS 进行确证和定量分析，大部分样品的GC/ECD 分析值与GC/MS/MS 分析结果一致。但有少部分样品，GC/ECD检测为假阳性。2、GC/AED技术虽然GC/MS 在农药多残留分析中很受欢迎，但它仍有局限性。当采用选择离子检测（SIM）或串联质谱（MS/MS）时，方法开发较为耗时，且GC 中任何保留时间的漂移都要求各个分析物的保留时间窗口相应移动。这些方法只能检测目标化合物表中所列的农药，还有几百种农药及代谢物可能检测不到。原子发射检测器（AED）是近年飞速发展起来的多元素检测器，它是利用等离子体做激发光源，使进入检测器的被测组分原子化，然后原子被激发至激发态，在跃迁至基态时发射出原子光谱。根据这些光谱的波长和强度即可进行定性和定量分析。所以，AED 属光度学检测器。由于它是原子（或原子离子）而不是分子激发后发射光，故称为原子发射检测器。AED具有许多独特的性能和应用，如：1、AED 可以以选择性和通用