第八章高效液相色谱分析.ppt

第八章高效液相色谱分析 第一节特点与分类 一 特点 高压 高效 高速 高沸点 热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法 第二节高效液相色谱法的主要类型及基本原理 一 液 固吸附色谱 liquid solidadsorptionchromatography 固定相 固体吸附剂为 如硅胶 氧化铝等 较常使用的是5 10 m的硅胶吸附剂 流动相 各种不同极性的一元或多元溶剂 基本原理 组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样 对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性 缺点 非线形等温吸附常引起峰的拖尾 二 液 液分配色谱 liquid liquidpartitionchromatography 固定相与流动相均为液体 互不相溶 基本原理 组分在固定相和流动相上的分配 流动相 对于亲水性固定液 采用疏水性流动相 即流动相的极性小于固定液的极性 正相normalphase 反之 流动相的极性大于固定液的极性 反相reversephase 正相与反相的出峰顺序相反 固定相 早期涂渍固定液 固定液流失 较少采用 化学键合固定相 将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶 担体 表面的游离羟基上 c 18柱 反相柱 三 离子交换色谱 ion exchangechromatography 固定相 阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂 流动相 阴离子离子交换树脂作固定相 采用酸性水溶液 阳离子离子交换树脂作固定相 采用碱性水溶液 基本原理 组分在固定相上发生的反复离子交换反应 组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径 电荷 存在形式等有关 亲和力大 保留时间长 阳离子交换 r so3h m r so3m h 阴离子交换 r nr4oh x r nr4x oh 应用 离子及可离解的化合物 氨基酸 核酸等 四 离子色谱 ionchromatography 离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一中技术 其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的 具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料 并采用淋洗液抑制技术和电导检测器 是测定混合阴离子的有效方法 有关内容将在第十章第六节中讲授 五 离子对色谱 ionpairchromatography 原理 将一种 或多种 与溶质离子电荷相反的离子 对离子或反离子 加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物 使其能够在两相之间进行分配 阴离子分离 常采用烷基铵类 如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子 阳离子分离 常采用烷基磺酸类 如己烷磺酸钠作为对离子 反相离子对色谱 非极性的疏水固定相 c 18柱 含有对离子y 的甲醇 水或乙腈 水作为流动相 试样离子x 进入流动相后 生成疏水性离子对y x 后 在两相间分配 六 排阻色谱色谱 size exclusionchromatography 固定相 凝胶 具有一定大小孔隙分布 原理 按分子大小分离 小分子可以扩散到凝胶空隙 由其中通过 出峰最慢 中等分子只能通过部分凝胶空隙 中速通过 而大分子被排斥在外 出峰最快 溶剂分子小 故在最后出峰 全部在死体积前出峰 可对相对分子质量在100 105范围内的化合物按质量分离 七 亲和色谱 affinitychromatograph 原理 利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力 进行选择性分离 先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂 环氧 联胺等 再连接上配基 酶 抗原等 这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留 改变淋洗液后洗脱 第三节固定相与流动相 一 液相色谱固定相 stationaryphasesoflc 1 液 液分配及离子对分离固定相 1 全多孔型担体由氧化硅 氧化铝 硅藻土等制成的多孔球体 早期采用100 m的大颗粒 表面涂渍固定液 性能不佳已不多见 现采用10 m以下的小颗粒 化学键合制备柱填料 2 表面多孔型担体 薄壳型微珠担体 30 40 m的玻璃微球 表面附着一层厚度为1 2 m的多孔硅胶 表面积小 柱容量底 3 化学键合固定相 化学键合固定相 目前应用最广 性能最佳的固定相 a 硅氧碳键型 si o cb 硅氧硅碳键型 si o si c稳定 耐水 耐光 耐有机溶剂 应用最广 c 硅碳键型 si cd 硅氮键型 si n 化学键合固定相的特点 1 传质快 表面无深凹陷 比一般液体固定相传质快 2 寿命长 化学键合 无固定液流失 耐流动相冲击 3 耐水 耐光 耐有机溶剂 稳定 4 选择性好 可键合不同官能团 提高选择性 5 有利于梯度洗脱 存在着双重分离机制 键合基团的覆盖率决定分离机理 高覆盖率 分配为主 低覆盖率 吸附为主 2 液 固吸附分离固定相 种类 硅胶 氧化铝 分子筛 聚酰胺等 结构类型 全多孔型和薄壳型 粒度 5 10 m 3 离子交换色谱分离固定相 结构类别 1 薄壳型离子交换树脂薄壳玻璃珠为担体 表面涂约1 的离子交换树脂 2 离子交换键合固定相薄壳键合型 微粒硅胶键合型 键合离子交换基团 树脂类别 1 阳离子交换树脂 强酸性 弱酸性 2 阴离子交换树脂 强碱性 弱碱性 4 空间排阻分离固定相 1 软质凝胶葡聚糖凝胶 琼脂凝胶等 多孔网状结构 水为流动相 适用于常压排阻分离 2 半硬质凝胶苯乙烯 二乙烯基苯交联共聚物 有机凝胶 非极性有机溶剂为流动相 不能用丙酮 乙醇等极性溶剂 3 硬质凝胶多孔硅胶 多孔玻珠等 化学稳定性 热稳定性好 机械强度大 流动相性质影响小 可在较高流速下使用 可控孔径玻璃微球 具有恒定孔径和窄粒度分布 二 液相色谱的流动相 mobilephasesoflc 1 流动相特性 1 液相色谱的流动相又称为 淋洗液 洗脱剂 流动相组成改变 极性改变 可显著改变组分分离状况 2 亲水性固定液常采用疏水性流动相 即流动相的极性小于固定相的极性 称为正相液液色谱法 极性柱也称正相柱 3 若流动相的极性大于固定液的极性 则称为反相液液色谱 非极性柱也称为反相柱 组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反 2 流动相类别 按流动相组成分 单组分和多组分 按极性分 极性 弱极性 非极性 按使用方式分 固定组成淋洗和梯度淋洗 常用溶剂 己烷 四氯化碳 甲苯 乙酸乙酯 乙醇 乙腈 水 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性 以改进分离或调整出峰时间 3 流动相选择 在选择溶剂时 溶剂的极性是选择的重要依据 采用正相液 液分配分离时 首先选择中等极性溶剂 若组分的保留时间太短 降低溶剂极性 反之增加 也可在低极性溶剂中 逐渐增加其中的极性溶剂 使保留时间缩短 常用溶剂的极性顺序 水 最大 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷 氯仿 溴乙烷 苯 四氯化碳 二硫化碳 环己烷 己烷 煤油 最小 4 选择流动相时应注意的几个问题 1 尽量使用高纯度试剂作流动相 防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加 2 避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子 如使固定液溶解流失 酸性溶剂破坏氧化铝固定相等 3 试样在流动相中应有适宜的溶解度 防止产生沉淀并在柱中沉积 4 流动相同时还应满足检测器的要求 当使用紫外检测器时 流动相不应有紫外吸收 第四节影响色谱峰扩展及色谱峰分离的因素 一 影响分离的因素与提高柱效的途径在高效液相色谱中 液体的扩散系数仅为气体的万分之一 则速率方程中的分子扩散项b u较小 可以忽略不计 即 h a cu故液相色谱h u曲线与气相色谱的形状不同 如图所示 1 液体的黏度比气体大一百倍 密度为气体的一千倍 故降低传质阻力是提高柱效主要途径 2 由速率方程 降低固定相粒度可提高柱效 3 液相色谱中 不可能通过增加柱温来改善传质 恒温 4 改变淋洗液组成 极性是改善分离的最直接的因素 二 流速 流速大于0 5cm s时 h u曲线是一段斜率不大的直线 降低流速 柱效提高不是很大 但在实际操作中 流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数 三 固定相及分离柱气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱 其选用原则与气相色谱一样 但在高效液相色谱中 分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作 一般很少自行制备 第五节高效液相色谱仪 高效液相色谱仪的结构示意见图 一般可分为4个主要部分 高压输液系统 进样系统 分离系统和检测系统 此外还配有辅助装置 如梯度淋洗 自动进样及数据处理等 其工作过程如下 首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱 然后从控制器的出口流出 当注入欲分离的样品时 流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离 然后依先后顺序进入检测器 记录仪将检测器送出的信号记录下来 由此得到液相色谱图 一 高压输液系统由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细 因此对流动相阻力很大 为使流动相较快流动 必须配备有高压输液系统 它是高效液相色谱仪最重要的部件 一般由储液罐 高压输液泵 过滤器 压力脉动阻力器等组成 其中高压输液泵是核心部件 对于一个好的高压输液泵应符合密封性好 输出流量恒定 压力平稳 可调范围宽 便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求 常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种 恒流泵特点是在一定操作条件下 输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关 恒压泵是指能保持输出压力恒定 但其流量则随色谱系统阻力而变化 故保留时间的重视性差 它们各有优缺点 目前恒流泵正逐渐取代恒压泵 恒流泵又称机械泵 它又分机械注射泵和机械往复泵两种 应用最多的是机械往复泵 二 进样系统 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多 约5 30cm 所以柱外展宽 又称柱外效应 较突出 柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽 主要包括进样系统 连接管道及检测器中存在死体积 柱外展宽可分柱前和柱后展宽 进样系统是引起往前展宽的主要因素 因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严 三 分离系统 色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件 它包括柱管与固定相两部分 柱管材料有玻璃 不锈钢 铝 铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属 玻璃管耐压有限 故金属管用得较多 一般色谱柱长5 30cm 内径为4 5mm 凝胶色谱柱内径3 12mm 制备往内径较大 可达25mm以上 一般在分离前备有一个前置柱 前置柱内填充物和分离柱完全一样 这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和 使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相 保证分离技的性能不受影响 柱子装填得好坏对柱效影响很大 对于细粒度的填料 20 m 一般采用匀浆填充法装柱 先将填料调成匀浆 然后在高压泵作用下 快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内 经冲洗后 即可备用 四 检测系统 在液相色谱中 有两种基本类型的检测器 一类是溶质性检测器 它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应 属于这类检测器的有紫外 荧光 电化学检测器等 另一类是总体检测器 它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应 属于这类检测器的有示差折光 电导检测器等 现将常用的检测器介绍如下 1 紫外检测器2 荧光检测器3 示差折光率检测器几乎所有物质都有各自不同的折射率 因此差示折光检测器是一种通用型检测器 灵敏度可达10 7g cm 3 主要缺点是对温度变化敏感 并且不能用于梯度淋洗 4 电导检测器5 附属系统它包括脱气 梯度淋洗 恒温 自动进样 馏分收集以及数据处理等装置 其中梯度淋洗装置是高压液相色谱仪中尤为重要的附属装置 第七节高效液相色谱分离类型选择 第八节毛细管电泳简介 在电解质溶液中 位于电场中的带电离子在电场力的作用下 以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象 称之为电泳 由于不同离子所带电荷及性质的不同 迁移速率不同 可实现分离 1937年 tiselius 瑞典 将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间 两端施以电压进行自由溶液电泳 第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和 球蛋白 发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定 第一次的自由溶液电泳 第一台电泳仪 1948年 获诺贝尔化学奖 二 经典电泳分析 利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术 按形状分类 u型管电泳 柱状电泳 板电泳 按载体分类 滤纸电泳 琼脂电泳 聚丙烯酰胺电泳 自由电泳 传统电泳分析 操作烦琐 分离效率低 定量困难 无法与其他分析相比 1981年 jorgenson和luckas 用75m内径石英毛细管进行电泳分析 柱效高达40万 m 促进电泳技术发生了根本变革 迅速发展成为可与gc hplc相媲美的崭新的分离分析技术 高效毛细管电泳 三 高效毛细管电泳分析 高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进 一是采用了0 05mm内径的毛细管 二是采用了高达数千伏的电压 毛细管的采用使产生的热量能够较快散发 大大减小了温度效应 使电场电压可以很高 电压升高 电场推动力大 又可进一步使柱径变小 柱长增加 高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱 理论塔板数高达几十万块 米 特殊柱子可以达到数百万 分离过程 电场作用下 毛细管柱中出现 电泳现象和电渗流现象 带电粒子的迁移速度 电泳 电渗流 两种速度的矢量和 正离子 两种效应的运动方向一致 在负极最先流出 中性粒子无电泳现象 受