植物组织培养1410510622.doc

植物细胞组织培养：指在离体条件下利用人工培养基对植物器官、组织、细胞、原生质体等进行培养，使其长成完整植株。细胞组织培养分类：植株培养、胚胎或子房培养、器官培养、茎尖分生组织培养、愈伤组织培养、细胞培养、原生质体培养。在农业中的作用：应用于快速繁殖和脱毒花药培养和单倍体育种胚培养、细胞突变体筛选体细胞无性系变异与筛选种质资源保存、基因库的建立植物次生代谢产物的生产原生质体培养和体细胞融合。脱分化：在细胞组织培养中，一个成熟细胞或分化细胞转变成为分生状态的过程，即形成愈伤组织的过程。再分化：植物的成熟细胞经历了脱分化之后，即形成愈伤组织之后，由愈伤组织能在形成完整的植株的过程。培养基分类：简化培养基：培养基的主要成分为天然复合物，如马铃薯培养基又叫天然物培养基。合成培养基：培养基的主要成分为各种人工化合物，根据不同的培养需要，按一定的配方比例配制而成（）固体培养基（）液体培养基外植体：在植物细胞组织培养中，由活体植物体上提取下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等，即供组织培养的离体植物材料。外植体再生植株的过程：接种培养-分化、增殖培养-生根壮苗培养-试管苗的移栽。愈伤组织：在人工培养基上由外植体形成的一团无序生长的薄壁细胞。胚状体：指在组织培养中从一个非合子细胞，通过合子胚相似的胚胎发生过程所形成的胚状结构。胚状体可以直接形成完整的植株。器官发生：由愈伤组织的部分细胞在形态结构上发生特化，使之与正常的愈伤组织有所不同，或者由外植体的部分细胞不经愈伤阶段而直接转化成出原形成层细胞，在进一步依次分化，形成初生芽和初生根，进而形成一个完整的植株，因为芽和根是整个植物的一种器官，所以这一过程成为器官发生。实验室设计和设备：准备室、灭菌室、接种室、无菌培养室、（细胞学实验室、摄影室、培养大棚）条件：温度23-27OC左右、湿度70-80%、光照强度1500-3000lx、光照时间10-16h设备：培养瓶、培养架、超净工作台、灭菌锅、接种工具、细菌过滤器、瓶口封塞、定时器、温度控制器、增湿器、去湿机、光照培养箱等。培养基:是组织培养中离体材料获取营养而赖以生存和发展的基质，是培养组织和细胞最重要的条件。培养基的组成对植物细胞的生长和代谢物质的生产影响极大。 外植体的种类：（1）带芽的外植体：包括茎尖、侧芽、原球茎、鳞芽、根茎连接处的萌蘖等。特点：形态建成已完成，易培养，遗传变异小，适宜离体快速繁殖，但易生根。培养诱导茎轴生长，抑制主轴发育，促进腋芽生长，产生丛生芽。（2）包括茎段、叶、根等营养器官及花茎、花萼、花瓣花药、子房、胚珠、幼胚、果实、种子等生殖器官。特点：分化已完成、须脱分化、难培养、较易产生变异，适宜做突变体筛选外植体长成植株的几种再生类型：（1）微型扦插产生小植株（2）先形成愈伤组织，然后分化出芽和根（3）通过胚状体途径形成小植株。消毒与灭菌的区别：消毒-采用物理或化学方法杀死物体表面的微生物。（不包括细菌的芽孢和真菌的孢子）灭菌-采用物理或化学方法杀死物体表面及其内部的一切微生物。（包括细菌的芽孢和真菌的孢子）常用器具的清洗方法：两步法：先碱洗:肥皂粉洗，清水洗刷净。后酸洗:铬酸+硫酸混合物浸入玻璃器皿后，自来水冲洗净。蒸馏水冲洗，晾干（或烘干），消毒备用。洗涤时，先放入洗涤液或清洁液中浸泡一定时间，用流水冲洗30分钟，蒸馏水冲洗，烘箱中烘干培养基主要成分：无机营养物、碳源和能源、维生素类、氨基酸及有机添加物、植物生长调节物质、琼脂、活性炭、PH值、水、肌醇。(四种典型培养基：MS、LS、B5、white.)大量微量元素配制注意事项：个化合物须充分溶解才能混合；混合时，将Ca2+与SO42-、HPO42-错开，避免产生沉淀；混合时要慢慢加入溶液，边搅拌边混合，配好后溶液澄清才好；Fe盐，植物生长调节剂须单独配成母液；IAA、IBA、GA3溶于少量酒精；NAA溶于热水或少量酒精；2，4-D溶于NAOH；BA、KT溶于HCL；玉米素溶于少量酒精。 无菌外植体的获取污染原因和预防措施-原因：外植体带菌、培养基及器皿灭菌不彻底、操作人员操作不当、接种工具灭菌不彻底等。措施：种子发芽获得无菌外植体；茎尖培养时，可在室内或无菌条件下对枝条进行预培养；避免阴雨天在田间采取外植体；对外植体进行消毒处理快速繁殖的做法：外植体-芽的诱导和增殖-继代培养-移植-检测-生根培养。类型：原球茎、器官发生型、胚状体发生型、器官型、无菌短枝扦插。快速繁殖意义：1）快繁可脱除无性繁殖植物体内的病毒，获得并保存无病毒种苗2）可加快繁殖系数低或种子繁殖困难的作物，如珍稀、特有或濒危种质资源3）加快繁殖不能用种子繁殖的植物或育种材料4）快速而经济地繁殖苗木5）经济、安全地保存植物种质资源常用培养基的配方及特点：MS培养基 特点：硝酸盐、钾和铵含量比其它培养基高，无机盐养分数量和比例较合适。适用于：愈伤组织、细胞、胚、茎尖、茎段、叶、花及花药等培养和形态建成。LS培养基 特点：大量元素、微量元素同MS, 有机成分不含甘氨酸、VB6 和烟酸。ER培养基 特点：与MS相比，降低了铵的含量，提高了P的含量，微量元素中的锌盐改用鳌合锌 适用于：豆科作物培养B5培养基 特点：含较低铵态氮，较高VB1适用于：双子叶植物特别是木本植物N6培养基 特点：KNO3和(NH4)2SO4含量高且不含钼 适用于：小麦、水稻及其他植物的花粉和花药培养和组织培养White培养基 特点：无机盐成分简单且含量低（仅及MS的1/3）适用于：生根培养、胚胎培养和一般组织培养马铃薯简化培养基 特点：铁盐与MS相同，绵白糖代替蔗糖，食用淀粉做凝固剂，马铃薯做培养基 适用于：小麦花药培养，其它组织培养脱毒的方法：茎尖脱毒、愈伤组织脱毒、珠心胚培养脱毒、茎尖微体嫁接脱毒培养抗病毒栽培种。脱毒苗的鉴定-直接测定法：观察症状；指示植物法：指示植物产生病斑；抗血清鉴定法：特定病毒的抗血清鉴定病毒；酶联免疫吸附法：酶标记抗原；电子显微镜检查法：观察病毒微粒；免疫吸附电镜法：抗体与病毒吸附，在电镜下可观察病毒粒子继代培养：组培中，培养物培养一段时间后为了阻止培养的细胞团老化，或培养基养分利用完而造成营养不良及代谢物过多累积毒害等的影响，要及时将其接种到新鲜的培养基中。分类：固体培养 液体培养。继代培养中会出现的现象：褐化；玻璃化；驯化现象；衰退现象。驯化现象：加入少量或不加生长调节剂就可以生长。玻璃化现象：在形态解剖特征上玻璃苗表现为半透明状，茎尖顶端分生细胞胶小，结构简单，较少维管束原组织，茎叶细胞体积膨大，液泡化程度高，肥质稀薄，细胞核变小，细胞无明显长轴现象。衰退现象：生长不良，再生能力和生殖能力下降。茎尖培养的生长情况及类型：生长正常，生长点伸长，基本无愈伤组织形成，1-3周形成小芽，4-6周长成小植株生长停止，接种物不扩大，渐变褐色至枯死。因茎尖受伤生长缓慢，接种物扩大缓慢，渐转绿，成一点绿。因培养条件不适生长过速，生长点不伸长或略伸长，大量疏松愈伤组织形成，需转入无激素培养基或降低培养温度等褐变现象：外植体茎尖多酚氧化酶的活性较强，褐变正是由于组织中的多酚氧化酶被激活，使酚类物质氧化产生棕褐色醌类物质，扩散到培养基中，抑制其它酶的活性，导致组织细胞部分坏死。发展状况：人工种子首次于1978年提出。成本还是太高，降低成本还是主要目标。优点：结构完整，体积小，便于运输和储藏；体细胞繁殖快，占用空间小，可批量生产人工种子；可增加产品产量，改进商品品质，提高作物抗性；对于育性不佳的材料，可保持种质资源，不致退化。人工种子的制作程序1）体细胞胚的诱导及同步化控制2）人造胚乳及人造种皮研制及包埋3）人工种子的贮存及萌发种质：亲代通过生殖细胞或体细胞传递给子代的遗传物质超低温保存：在液氮（-196）的超低温下使细胞代谢和生长处于基本停止的状态，在适宜的条件下可迅速繁殖，再生出新的植株，并保持原来的遗传特性胚胎培养：从种子中把胚分离出来，接种到人工培养基上进行培养，使其发育成幼苗的过程。实际应用：远缘杂交中克服杂种不育；种子发育不全的植物通过胚胎培养得到大量后代；克服种子休眠，缩短育种周期；柑橘类合子胚培养、种子生活力测定；种质的超低温保存。单倍体植物：体细胞中只具有配子染色体数的个体，其基因型是半合子状态的，如使其染色体数加倍，便可直接成为纯合的二倍体（双倍体）。体细胞无性系变异1）变异来源：继代培养时间增加、起始外植体预先存在变异2）变异类型：染色体数目变异、染色体结构变异、基因变异、可遗传变异和非遗传变异后生遗传变异;在细胞的发育和分化过程中，对基因表达调控上所发生的变化，而不涉及基因结构的改变。生理适应变异：指由某种外界条件存在而引起的生理饰变，一旦这种外界条件不存在时，变异也自行消失。应用：生化代谢途径的研究、体细胞杂交的选择标志、作物遗传改良、雄性不育突变体抗氨基酸及氨基酸类似物突变体、耐盐突变体、抗除草剂突变体、抗病突变体离体受精：在离体无菌条件下完成从授粉、花粉萌发到花粉管进入胚囊直至精核与卵核或极核融合的双受精及胚和胚乳发育的全过程。实际应用：在远缘杂交上的应用，在克服自交不亲和性上的应用，在诱导单倍体植物上的应用。花药培养预处理：低温法、乙烯利喷射植株，离心花蕾、低剂量射线照射 材料的消毒和接种：诱导培养：分化培养雄核发育花粉：花药培养中小孢子偏离配子体发育途径的花粉雄核发育的主要途径（四条途径）小孢子途径（B途径）营养细胞发育（A途径）生殖细胞发育（A-G途径）由生殖细胞和营养细胞同时发育（C途径）细胞培养方法：细胞悬浮培养和平板培养法。原生质体培养类型:固体培养法、液体培养法（小滴培养法、浅层培养法）、固液结合培养法。植物遗传转化：外源基因转移到植物体内并稳定整合表达与遗传的过程.方法:农杆菌介导法、基因枪法、植物原位真空渗入法、电击法、聚乙二醇法、花粉管通道法、显微注射法、激光微束法、超声波法、生殖细胞浸泡法、脂质体法等优缺点分析1）农杆菌介导法优点：Ti或Ri质粒转化机理研究最清楚，方法最成熟，应用最广泛。利用天然的遗传转化系统，成功率高，效果好。T-DNA区可插入50Kb的外源DNA片段。T-DNA上可引导 DNA转移和整合，有功能启动子和转录信号，能使外源片段表达。连接的启动子可改变,使表达具有特异性。细胞培养应用范围和意义:1)为研究细胞的形态、生长、生理、生化、分化和遗传提供一个良好的实验系统2)为细胞水平的遗传工程研究提供理想的材料和应用途径3)为植物快速繁殖开辟新途径，为人工种子工程提供技术基础4)最适宜用于体细胞突变体的诱导和筛选5)可用于某些有特殊价值的天然化合物的工厂化生产.原生质体培养意义：1）应用于植物细胞骨架、细胞壁的形成与功能、细胞膜的结构与功能、细胞分化与脱分化等2）应用于外源基因转移、体细胞杂交、无性系变异及突变体筛选3）1993年国际上已在49个科146个属的320多种植物上建立了原生质体培养植株再生技术人工种子：将植物组织培养中所产生的体细胞胚胎或珠芽包埋在“人工胚乳”和“人工种皮”里，具有播种功能的类似天然种子的颗粒体缺点：转化效率低。寄主限制在双子叶植物。操作复杂，周期长。2）基因枪法 优点：不受物种限制、受体广泛、操作简便迅速，转化频率较高、射速、射入量容易控制缺点：转化表达频率高，但遗传比例极低、转化频率低、外源DNA整合机理尚不清楚。名词解释：1再分化：植物的成熟细胞经历了脱分化之后，即形成愈伤组织之后，有愈伤组织能再形成完整的植株的过程。2.愈伤组织：在组织培养中，受伤组织切口表面在适宜条 件下长出的一种脱分化的组织堆块，称为愈伤组织（Callus）。3.脱分化：在细胞组织培养中，一个成熟细胞或分化细胞转变成为分生状态的过程，即形成愈伤组织的过程。4.胚状体：指在组织培养中从一个非合子细胞，通过合子胚相似的胚胎发生过程所形成的胚状结构。胚状体可以直接形成完整的植株。5.细胞培养：是指植物细胞、组织、器官或整株植物在无菌条件下离体培养的技术6.细胞质杂种：指一个正常的原生质体和一去核的原生质体融合或和一核失活的原生质体融合产生的杂种。7.连续培养：（继代培养）在植物组织培养中，培养物培养一段时间后，为了阻止培养的细胞团老化，培养基养分利用完而造成营养不良及代谢物过多积累毒害等的影响，要及时将其接种到新鲜培养基中。8.植板效率（填空）：植板率（）每平板新形成的细胞团数/每平板接种细胞数1009.后生遗传变异：在细胞的发育和分化过程中，对基因表达调控上所发生的变化，而不涉及基因结构的改变。9.双极性：指在细胞发育的初期，其内含物的分布具不均匀性，形成胚性细胞后具有发育成芽端的潜在能力。10.人工种子：通过植物组织培养的方法获得的具有正常发育能力的材料，外面还被有特定物质在适宜条件下可以发芽成苗的植物幼体。11.生殖隔离：是指体细胞胚与母体组织或外植体的维管束系统无直接联系，胚状体与周围组织间形成缝隙，处于较独立的状态。12.离体受精：在人工控制条件下使离体的胚珠或子房完成授粉、受精，形成种子的过程13.转换：由体细胞胚发育成具有正常表现型的绿色植物的能力14.分化：指受特定条件的影响导致细胞结构和功能的改变，导致发育方式改变的过程9.BAP：6-卞氨基嘌呤10.CH：水解酪蛋白11.DMSO：二甲基亚砜 12.EDTA:乙二胺四乙酸盐13.VB6：盐酸吡哆醇14.GA3：赤霉素15.IAA：吲哚乙酸16.KT：激动素17.RAPD：随机扩增多态性18.PCV：细胞密实体积19.N6：禾本科作物花药培养的培养基20.CPW：细胞-原生质体清洗液21.VB1：盐酸硫胺素填空题：1植物细胞和组织培养的理论基础是：植物细胞的全能性2培养基的常见主要成分是：水，无机成分，有机成分3选择适宜的外植体需要从：植物基因型，外植体部位，外植体大小，取材季节以及外植体的生理状态和发育年龄等方面加以考虑4高质量的体细胞胚，指体细胞胚具有发育成再生植株的能力，这就要求体细胞胚在解剖构造上具有明显的两极性，类似合子发育中的种子结构5细胞培养能生产的次生产代谢产物包括：生物碱，类固醇，菇类化合物，醌类，Y-吡喃酮类，生物活性物质，酶类6植物遗传转化的方法有：农杆菌介导法，基因枪法，植物原位真空渗入法，花粉管通道法，电击法，聚乙二醇法，显微注射法，激光束法，超声波法，生殖细胞浸泡法以及脂质体法7植板效率=形成细胞团数/植板的细胞总数*100%8细胞干重是以每毫升培养物或每10的6次方个cell的重量表示，细胞密实体是以每毫升培养液中cell总体积的毫升数表示；细胞计数通常使用血球计数核9愈伤组织是指植物在受伤后其伤口表面形成的一团薄壁细胞10脱分化是指一个成熟cell以及分化cell成为分生状态的过程，即形成愈伤组织的过程11体细胞胚是指在愈伤组织表面或内部形成类似于合子胚的结构12褐变包括酶促褐变和非酶促褐变，植物主旨培养中褐变主要有酶促引起的，多酚氧化酶（PPO）是植物体内普遍存在的一类末端氧化酶，它催化酶类化合物形成醌和水，醌在经过非酶促聚合，形成深色物质，对外植体材料产生毒害作用，影响其生长与分化，严重时导致死亡13旺盛生长的愈伤组织其质地有显著差异，可分为松脆型以及坚硬型两类，两者可互相转化。当培养基中生长素类浓度高时，可使愈伤组织块变为松脆，相反，降低或去除生长素，愈伤组织转变为坚实的小块14植物细胞全能型的实现是从已经脱分化的细胞中分化出组织器官，即在特定的离体培养条件下经历器官发生过程形成根和芽，或经历胚胎发生过程形成胚状体最后发育成完整的植株15植物激素对胚型细胞的分化起重要作用，2，4-D是一个重要的基因表达调控物质，即通过改变IAA代谢的作用，经过一系列合成代谢途径，细胞内mRNA，蛋白质等的变化最终调节基因的表达，诱导胚性细胞的分化16细胞的增殖是通过cell周期实现的，即细胞通过一系列有序发生的细胞内事件实现cell生长分裂和增殖的过程。有证据表明钙离子参与植物cell周期的调控过程，发现钙调素在细胞外可促进细胞增殖，白芷和胡萝卜悬浮培养细胞的细胞壁区以及介质中检出并纯化了21ku钙调素结合蛋白，这说明细胞壁上有CaM的结合位点，通过细胞外CaM结合蛋白以及其他跨越细胞壁，质膜的途径传递外界信号，就可以调节细胞的生长和分化。极性的形成是胚性细胞完成分化和发育的主要特征之一。外源生长调节物质既是体细胞分化为胚性细胞的诱导因子，也是诱导胚性细胞极性形成的重要因素17基因型确定后，制备原生质体的材料需考虑材料特性和生理状态。通常，茄科作物和木本植物选取生长旺盛，生理状态一直的刚展开的幼嫩叶片为游离原生质体的好材料。十字花科的植物从种子萌发4-5d的无菌苗下胚轴上分离原生质体，豆科植物则用未成熟种子胚的子叶作为制备原生质体的好材料；对禾本科植物，特别要注意从幼胚，幼橞，花药或成熟胚建立胚性愈伤组织中分离原生质体有利于再生18用于降解细胞壁的酶通常有纤维素酶，半纤维素酶，果胶酶等，酶的PH值通常被调节在4.76.0之间。对酶的活性来说，最适宜温度是45-50C，而对细胞来说，这温度太高，一般分离的原生质体温度以25-30C为宜缩写：BAP：6-苄氨基嘌呤 CH：水解酪蛋白 DMSO：二甲基亚砜 EDTA：乙二胺四乙酸盐VB6：盐酸吡哆醇 GA3：赤霉素 IAA：吲哚乙 KT：激动素RAPD：随机扩增多态性 PVC：细胞密实体积PCV VB1：盐酸硫胺素N6：禾本科作物花药培养的培养基 CPW：细胞原生质体清洗液连线：1.植物组织培养的全过程：外植体（细胞） 脱分化 愈伤组织 再分化 不定器官/体细胞胚 完整植株。2.外植体消毒步骤：外植体取材 自来水冲洗 70%或75%酒精表面消毒（2060S） 无菌水冲洗 消毒剂处理 无菌水冲洗2-3次 接种。3.人工种子制作程序：体细胞胚的诱导 同步化控制 人工种皮及胚乳包埋 人工种子贮存及萌发。4.茎尖脱毒培养繁育程序：采样 病毒鉴定 去外叶 剥离茎尖 切取分生组织 茎尖培养 茎尖再生植株 防虫网内繁殖脱毒苗6.原生质体培养步骤：酶解 液体培养 原生质体纯化 分离收集原生质体 生成胚状体 成长为植株7.超低温保存的基本程序：材料的准备预处理加入冷冻保护剂降温冷冻快速解冻种质保存再培养遗传稳定性、生活力等鉴定8.玻璃化冷冻的基本程序：预培养和低温锻炼保护剂加前过度或逐级递加保护剂成分及保护剂处理时间和温度被冻体积、降温方式化冻和洗涤活性检测和恢复培养9.农杆菌介导的遗传转化工作：植物表达载体的构建转化体系的建立目的基因的转化转话体的筛选与获得转基因植物的分子检测与转基因植物的获得10.基因枪转化的基本程序:手提材料的预备微弹的制备转化后植物体的培养与植株再生转基因植株的分子检测基因枪转入11.植株原位真空渗入法的程序：真空渗入 采集种子与转化种子筛选 分子检测 适宜苗态建成（以上2题没答案，顺序有错，需调整）12.体细胞杂交的步骤：原生质预备原生质融合杂种细胞选择杂种细胞培养杂种植株再生以及杂种植株鉴定13.快速繁殖技术步骤：外植体接种起始培养生根培养继代培养驯化及移栽选择：2.下列简写代码中细胞分裂素有 ZT,E,B9 生长素有IAA3.下列培养方式中子房剥离培养会产生单倍体植株，茎尖培养，细胞培养容易引起体细胞变异4.为了提高茎尖脱毒效果，可以对材料进行预处理如;热处理，再剥离茎尖培养或者先获得无病毒苗木，如：微体嫁接。5.在花药立体培养中，选株小孢子发育的最好时期是：单核早期，单核中期，单核晚期，双核期。6.花药花粉培养的单倍体植株的加倍方式有：秋水仙素处理，自然加倍，弗乐灵处理。7.花粉小孢子培养方法有:液体浅层培养，平板培养，看护培养，微室悬滴培养，条件培养。8.花药分裂增值的方式有：营养细胞发育，生殖细胞发育，营养细胞和生殖细胞共同发育，花药小孢子均等分裂。9.植物病毒的鉴定和检测方法：指示植物法，抗血清鉴定法，电子显微镜鉴定法，酶联免疫测定法。10.植物病毒的介质传播方式有：昆虫传播，线虫传播，螨传播。11.植物病毒的接触传播方式有;自然接触，汁液接种，人为接触，嫁接及菟丝子的桥接12.体细胞同步化的方法有：化学抑制法，低温抑制法，渗透压选择法，机械过筛选择法，应用植物胚性细胞分级仪。13.外植体的器官发生途径：腋芽萌发，不定芽发生，体细胞的胚胎发生。14.器官发上再生植株的方式有：先分化出芽再分化出根，先分化出根再分化出芽，先形成遇上组织在分化出芽或根。15.愈伤组织形成需要经过的三个阶段是：启动期、分裂期、分化期。16.单细胞培养的方法：平板培养，看护培养，微室悬滴培养，纸桥培养法17.胚状体发生途径同其他发生途径相比，其特点表现在：具有明显的两极性，遗传稳定性，发生数量大，增殖率高18.体细胞发生类型有：愈伤组织产生胚状体；悬浮细胞产生胚状体。19.影响体细胞胚胎发生的因素有：极性和生理隔离；外植体的遗传背景；外植体的生理年龄；植物激素；矿质元素和有机化合物。20.下列培养方式形成的植株会有三倍体的是：胚乳培养。22.原生质体的培养方法有：液体培养；固体培养；液固结合培养；饲料培养。23.原生质体融合的方法有：自发融合；离子融合；物理融合；PEG融合；离子和PEG结合的融合。24.体细胞的杂种植株的鉴定方法有：形态学鉴定；细胞学鉴定；同工酶鉴定；分子生物学鉴定。25.超低温保存中，降温冷冻的方法有：快速冷冻法；慢速冷冻法；2步冷冻法；逐级冷冻法。26.超低温保存中，化冻的方法有：快速化冻法；慢速化冻法。27.下列冷冻保护剂有：甘油。29.低氧系统是在正常气压101308Pa下，加入氮气等惰性气体使其中的氧分压降到预定大小。30.根癌农杆菌携带的是Ti 质粒，发根农杆菌中携带的是Ri 质粒。解答：1 以1LMS培养基为例，简要说明培养基的制备过程1）分别取大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，铁盐母液5ml，烟酸 ，盐酸吡哆醇 ，盐酸硫胺素 ，肌醇 ，甘氨酸 。于一个1L烧杯中混合。2）称7g琼脂和适量蔗糖在烧杯加水溶解，加热溶解。3）将1与2混合搅拌均匀，加水至1000ml。4）调节PH至5.8。5）将配好溶液分装到十个三角瓶中，封口包装。6）灭菌，冷却备用。2 外植体污染的原因及对策原因：外植体带菌、培养基及器皿灭菌不彻底、操作人员操作不当、接种工具灭菌不彻底等对策：1）种子发芽获得无菌外植体，茎尖培养时，可在室内或无菌条件下对枝条进行预培养，2）避免阴雨天在田间采取外植体，对外植体进行消毒处理。3）培养基、器皿、接种工具等要进行彻底灭菌。操作人员使用正确的操作方法。3 外植体褐变的防止措施1） 选择适宜的外植体和培养条件2） 加入抗氧化剂：如：抗坏血酸 PVP柠檬酸硫代硫酸钠 3）切割外植体选用不锈钢工具，切割时迅速敏捷，减少伤口在空气中暴露的时间4 影响器官分化的因素1）培养基成分：激素 矿质元素2）环境条件：光照 温度 湿度 3）植株材料：品种基因型 生理状况 不同器官5影响体细胞胚胎发生的因素1） 极性和生理隔离2） 外植体的遗传背景3） 外植体的生理年龄等4） 植物激素5） 矿质元素6） 有机化合物6 脱毒苗培育的意义1)获得无病毒苗2)增加产品品质，改进商品品质。3）提高作物抗性。7单倍体的应用价值1） 在植物育种中使后代迅速纯合2） 提高选择效率3） 排除杂种优势对后代选择的干扰4） 遗传研究的良好实验材料体系5） 突变体的筛选6） 消除致死基因7） 选育新型自交系8） 遗传转化的受体材料8 影响细胞悬浮培养的因素1）基本培养基的组成：氮 磷 硫 镁、钾、钙 氯 微量元素2）有机成分：氨基酸类 维生素类3）碳源 4）植物激素：生长素类 细胞分裂素 乙烯5）培养基的PH值及渗透压6）培养基成分对细胞悬浮物组成的影响7）振荡频率：80-100r/min8）培养条件：2639.杂种细胞的选择方法？1）细胞系互补的选择方法；2）利用物理特性差异的选择方法；3）依据生长特性差异的选择方法10 举