荧光假单胞菌工程菌株的构建PPT课件.ppt

荧光假单胞菌工程菌株的构建 1 荧光假荧荧光假单胞菌简介光假单胞菌简介单胞菌简介 细胞有多根极生鞭毛 可水解明胶 不产生绿脓菌素 氧化酶反应阳性 精氨酸双水解酶阳性 产生黄绿色荧光色素 不需要生长因子 能利用葡萄糖和芳香族化合物生长 不利用淀粉 细胞可为EDTA溶解 最高生长温度为35 37C 2 荧光假单胞菌简介 荧光假单胞菌有8个种 其中菊苣假单胞菌 丁香假单胞菌和绿黄假单胞菌是植物致病菌 铜绿假单胞是机遇性人体致病菌 偶尔也造成洋葱腐烂 另外4个种是腐生性的 分别为荧光假单胞菌 绿针假单胞菌 致金假单胞菌和恶臭假单胞菌 这些种类均能产生扩散性荧光色素 但与植物病害防治有关的主要是荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌 3 预期前景 荧光假单胞菌对多种植物病害具有防治作用 它首先在植物根际定殖 然后靠噬铁索对铁离子的竞争和抗生素的拮抗作用抑制病原菌的生长发育 保护植物体免受病菌危害 荧光菌在根际的定殖能力与它同根系分泌物的凝集能力有关 与它在根表的短期不可逆吸附也有一定关系 大多数好气性和兼性厌气微生物能产生一种低分子量化合物 用以在低铁生境中获取铁索营养 这种物质对铁离子Fe3 具有专一的高度亲和性 称为噬铁素 Siderophore 荧光假单胞菌的水溶性荧光色素就是一种噬铁素 这类细菌对植物生长发育导有良好刺激作用 并能防治某些植物根部病害 是植物病害生物防治中研究较多的一类噬铁素产生菌 4 荧光假单胞菌工程菌株的构建 目的基因的获取荧光假单胞菌2 4DAPG的合成基因簇已经被克隆和测序 其中phlACBD作为一个操纵子负责合成2 4DAPG及其前体 在其下游phlE基因与phlACBD共转录 与2 4DAPG外泌和细胞抗逆性相关 phlF基因位于phlACBD操纵子上游 以相反的方向转录 编码一种2 4DAPG阻遏蛋白 该蛋白在phlA和phlF间隔区与phOA位点结合阻遏了RNA合成酶与phlA启动子的 10区结合 抑制了phlACBD基因的转录 从而抑制了2 4DAPG的合成 但是少量合成的2 4DAPG与phlF蛋白结合 解除了这种抑制重要 可使2 4DAPG大量合成 5 荧光假单胞菌工程菌株的构建 荧光假单胞菌感受态细胞的制备材料及方法1 培养基LB培养基 蛋白胨10g 酵母粉5g NaCl10g 蒸馏水1000mL pH7 5 选择培养基 在LB培养基中加入四环素至终浓度25g mL 沙 玉米粉培养基 沙98份 玉米粉2份 水少许 6 荧光假单胞菌工程菌株的构建 将荧光假单胞菌接种于LB液体培养基中 于28 振荡培养过夜 以1 的接种量转接于10mL新鲜的LB培养液中 于28 240r min振荡培养至OD约0 53 冰浴30min 离心收集菌体 加入5mL预冷的0 025mol LCaCl2处理2h 离心 菌体用1mL预冷的0 025mol L的CaCl2悬浮备用 7 荧光假单胞菌工程菌株的构建 转化将1 2 L 约1 g pMON5122质粒DNA与200 L感受态细胞混匀 冰浴放置30min 42 热激3min 冰浴中放置5min 加入800 LLB液体培养基 振荡培养1h 按每皿100 L涂布于含四环素的平板上 28 培养约40h 挑取抗性菌落进行纯培养 8 荧光假单胞菌工程菌株的构建 鉴定工程菌株的构建策略 将pMON5122质粒通过转化方法克隆入荧光假单胞菌感受态细胞中 根据克隆子的四环素抗性筛选出在四环素平板上生长的转化子 提取阳性重组子中的质粒pMON5122 用Hind 和EcoR 进行双酶切后 产生2个片断 大小分别为1015kb 与载体pRK415大小相同 和6 5kb 其中的小片段为DAPG合成基因表明DAPG合成基因已经导入荧光假单胞菌野生菌株中 9 荧光假单胞菌工程菌株的构建 分析 大多数细菌转化方法都依据Mandel和Higa在1970年的发现 首先用冰预冷的CaCl2溶液处理细菌然后作短暂的热处理 该处理方法改变了细胞膜的结构 在受体细胞中诱导了一种短暂的 感受态 使质粒DNA能够穿过细菌细胞膜进入细胞 因此 CaCl2的浓度和热处理时间对质粒的转化至关重要 用质粒转化大肠杆菌时 通常CaCl2浓度为011mol L 42 热激90s 但在本试验中 当CaCl2浓度为0 025mol L 42 热激3min时 转化频率最高 10 荧光假单胞菌工程菌株的构建 CaCl2浓度对转化频率的影响Ca2 在低温时可以使细胞壁的通透性及细胞表面的正电荷增加 这些改变有利于DNA的吸附和吸收 本试验用不同浓度的CaCl2即0 020 0 025 0 030和0 040mol L处理荧光假单胞菌细胞 结果表明 用0 025mol LCaCl2处理荧光假单胞菌细胞转化频率最高 0 040mol LCaCl2处理转化频率最低 随着CaCl2浓度的提高 转化频率呈现升高 降低的变化趋势 浓度超过0 025mol L时 转化频率急速下降 11 荧光假单胞菌工程菌株的构建 热激时间对转化频率的影响本试验在42 时分别处理1 2 3 4min 目的在于促进荧光假单胞菌对DNA的吸收 热激时间直接影响转化子的形成 结果表明 处理1 2min时 没有转化子形成 处理3 4min时 转化频率较高 12 荧光假单胞菌工程菌株的构建 生长时期