酵母双杂交原理与实验具体流程.ppt

酵母双杂交系统原理及具体操作流程 酵母双杂交系统可进行两个蛋白互作分析 可用一个已知的蛋白因子 在双杂交系统中称为诱饵蛋白 去钓取与其结合的蛋白 也可用进一步验证两个蛋白之间的互作 应用Clontech第三代酵母双杂交系统 并在按实验手册要求的严格操作下进行蛋白互作分析 我们的筛选结果将具有较好的重复性与可靠性 单 双杂交的方法是基于许多真核生物转录因子都是以模块形式存在的 它们的转录激活域和DNA结合域在结构和功能上都有区别 这就允许研究者去构建不同的融合基因 当在酵母中表达融合蛋白 能立即结合DNA靶序列激活下游启动子的转录 图1所示 BDMatchmaker系统应用酵母中已经研究透彻的转录因子GAL4的转录激活域和DNA结合域来进行研究 单杂与双杂的异同点 酵母单双杂 都基于许多真核生物转录因子的转录激活域和DNA结合域在结构和功能上都有区别 这就允许研究者去构建不同的融合基因 当在酵母中表达融合蛋白 就能结合DNA靶序列激活下游启动子的转录 单杂交是文库中的转录因子直接与靶序列结合 使与转录因子融合的GAL4AD激活报告基因HIS3的转录 而双杂是借助与诱饵蛋白与文库中调控因子的互作 使得GAL4BD和AD通过这个 桥梁 共同起作用 激活报告基因 ADE2 HIS3 lacZ和MEL1 的转录 推荐使用Clontech公司的第三代载体 pGADT7 Rec和pGBKT7进行双杂交筛选 因为它们产生更少的假阳性 对于cDNA合成 构建一个与GAL4激活域的融合文库 在双杂交中推荐使用pGADT7 Rec 这一克隆是通过体内同源重组来实现的 图2 这一步骤是利用酵母中的高效重组系统使dsDNA与GAL4AD质粒融合 借助于同源重组克隆 文库的构建和筛选能快速接连地进行 步骤3和4 不需任何细菌转化步骤 用cDNA文库和pHIS2载体进行简单的酵母转化 接着在选择性培养基上进行酵母双杂交的筛选 图2 BDMatchmakerTM双杂交文库构建和筛选 上图所示 借助于重组克隆使文库构建和筛选快速有效 Yeastpromotersandothercis actingregulatoryelementsplayacrucialroleinyeast basedexpressionsystemsandtranscriptionalassayssuchastheMATCHMAKEROne andTwo HybridSystems DifferencesinthepromoterregionofreportergeneconstructscansignificantlyaffecttheirabilitytorespondtotheDNA bindingdomainofspecifictranscriptionalactivators promoterconstructsalsoaffectthelevelofbackground orleakiness ofgeneexpressionandthelevelofinducedexpression Furthermore differencesincloningvectorpromotersdeterminethelevelofproteinexpressionand insomecases confertheabilitytoberegulatedbyanutrient suchasgalactoseinthecaseoftheGAL1promoter UASandTATAregionsarebasicbuildingblocksofyeastpromotersTheinitiationofgenetranscriptioninyeast asinotherorganisms isachievedbyseveralmolecularmechanismsworkinginconcert Allyeaststructuralgenes i e thosetranscribedbyRNApolymeraseII areprecededbyaregioncontainingalooselyconservedsequence TATAbox thatdeterminesthetranscriptionstartsiteandisalsoaprimarydeterminantofthebasaltranscriptionlevel Manygenesarealsoassociatedwithcis actingelements DNAsequencestowhichtranscriptionfactorsandothertrans actingregulatoryproteinsthatbindandaffecttranscriptionlevels Theterm promoter usuallyreferstoboththeTATAboxandtheassociatedcis regulatoryelements ThisusageisespeciallycommonwhenspeakingofyeastgeneregulationbecausethecisregulatoryelementsarerelativelycloselyassociatedwiththeTATAbox Yoccum 1987 Thisisincontrasttomulticellulareukaryotes wherecisregulatoryelements suchasenhancers canbefoundveryfarupstreamordownstreamfromthepromoterstheyregulate Inthistext minimalpromoter willreferspecificallytotheTATAregion exclusiveofothercis actingelements Theminimalpromoter orTATAbox inyeastistypicallyapproximately25bpupstreamofthetranscriptionstartsite YeastTATAboxesarefunctionallysimilartoprokaryoticPribnowboxes butarenotastightlyconserved Furthermore someyeasttranscriptionunitsareprecededbymorethanoneTATAbox TheyeastHIS3gene forexample isprecededbytwodifferentTATAboxes TR whichisregulated andTC whichisconstitutive UASandTATAregionscanbeswitchedtocreatenovelpromotersForGAL4 basedsystems eitheranativeGALUASorasyntheticUASG17 merconsensussequence Heslot Gaillardin 1992 providesthebindingsitefortheGAL4DNA BD Ifyouareputtingtogetheryourownone ortwo hybridsystem youmustmakesurethatthereportergene spromoterwillberecognizedbytheDNA BDmoietyencodedinyourDNA BDfusionvector ReportergenesunderthecontrolofGAL4 responsiveelementsAH109containsfourreporters ADE2 HIS3 MEL1 andlacZ underthecontrolofthreedistinctGAL4upstreamactivatingsequences UASs andTATAboxes TheADE2reporteraloneprovidesstrongnutritionalselection Forhigherstringency andtoreducetheincidenceoffalsepositives selectforADE2andHIS3 Jamesetal 1996 YoualsohavetheoptionofassayingforMEL1 whichencodes galactosidase MEL1isendogenoustobothY187andAH109 Because galactosidaseisasecretedenzyme itsactivitycanbedetectedbyaddingX Galtotheselectionplate IfMEL1isactiveandX Galispresent thecolonywillturnblue lacZinY187exhibitsahighlevelofinduced galactosidaseactivityinapositivetwo hybridassaybecauseitisunderthecontroloftheintactGAL1UAS ReportergenesunderthecontrolofaminimalHIS3promoterTheHIS3reportergeneinyeaststrainY190isunusualamongtheGAL4two hybridreportergeneconstructsinthatitisunderthecontroloftheGAL1UASandaminimalpromotercontainingbothHIS3TATAboxesTheHIS3reporterplasmidspHISiandpHISi 1usedintheMATCHMAKEROneHybridSystemalsohavebothoftheHIS3TATAboxespresentintheminimalpromoter Byinsertingacis actingelementintheMCS theregulatedTATAbox TR canbeaffected butthereisstillasignificantamountofconstitutive leakyexpressionduetotheHIS3TC TheleakyHIS3expressionoftheseone hybridplasmidsisfirstusedtohelpconstructHIS3reporterstrains andlateriscontrolledbyincluding3 aminotriazoleinthemediumtosuppressbackgroundgrowth Promotersusedtodrivefusionproteinexpressionintwo hybridcloningvectors cDNA的生成 RT PCR及RACE 一般提取的RNA中 都含有少量的植物DNA 在RT PCR时 为避免基因组DNA的存在而造成扩增产物的污染问题 需在RNA溶液中加入少量无RNase的DNase 于37 消化30min后 在进行反转录 建议应在无菌操作台上进行反转录体系的配制 在实验中 往往需要获得基因的全长 那么就需做5 RACE RapidAmplificationofcDNAEnd 与3 RACE 我们就以Clontech公司的SMART SwitchingMechanismat5 endofRNATranscript 技术来探讨RACE反应 何为SMART技术 顾名思义 SMART RNA转录5 端转换机制 它实际上指RNA在MuMLV反转录酶的作用下 将RNA反转录为第一链cDNA 引物一般用Oligo dT 当MuMLV反转录酶遇到RNA的5 端时 它就展示出其末端转移酶活性 一般是在cDNA的3 端加上几个碱基 首先并且主要是胞嘧啶 C 而BDSMART引物的3 端具有Oligo G 与胞嘧啶互补配对 则创造出一个延伸性的模板 SMART引物的5 端 如下图所示 接着反转录酶转换模板 也就是以SMART引物的5 端序列为模板继续合成第一条cDNA链 这样就使得cDNA具有mRNA的完整5 末端并同时含有SMARTOligo的互补序列 然后通过长距离PCR扩增出具有完整5 端的双链cDNA 反转录酶可以说是一种特殊的聚合酶 前人研究表明 聚合酶一般在新合成链的3 端加上同聚尾 几个相同的碱基 不同种类的聚合酶所加的碱基种类和数目不一样 如Taq酶一般在扩增片段的3 端加上一个 A 而反转录酶是加上3个 C 对此 研究人员巧妙地应用了反转录酶的天然活性 并精心设计了SMARTOligo和CDS引物 开发出SMART技术 当前 SMART技术在新基因全长获得的实验中具有广泛地应用 dscDNA 0 4 4kb 电泳图 DestroyRNAsecondarystructure secondarystructurenottobeformedagain 2020 3 17 20 可编辑 Screeningbycotransformation ScreeningByYeastMating Y187suspension Pull down TroubleshootingGuide A ConstructingDNA BDfusionsDNA BD baitactivatesreportergenesBaitproteinistoxictoyeastcellsB GeneratingcDNAlibrariesLowyieldofdsDNASizedistributionofdsDNAislessthanexpectedPresenceoflowmolecularweight 0 1kb indsDNAfragmentsC Constructing ScreeningY2HLowtransformationefficiencyLowmatingef