内毒素LAL检测使用说明(中文版) 2.doc

Page 1前协议定量检测协议 ToxinSensor 显色 LAL 内毒素检测试剂盒 执行所有的测试步骤，在室温下。操作前请使用认证的内毒素免费产品。样品制备所有材料或稀释剂用于标本收集和准备，测试试剂必须无内毒素。在任何时候都使用无菌技术。待测样品必须存储在所有细菌活动受阻的方式中。例如，样品之前使用，24 小时内可以存储在 2-8 C，但长期使用需要冻结。pH 溶解或稀释试样用 LAL 试剂水。由于 LAL 内毒素反应是依赖 ph的，故样品的 pH 值应为 6-8，确保良好的线性度。因此， 如有需要，我们推荐使用氢氧化钠 (0.1 N，溶解在LAL试剂水中) 或盐酸 (0.1 N，LAL 试剂水稀释)调pH 值 。 I.试剂制备、鲎试剂溶解物 (LAL) 再造冻干裂解液加 1.7 毫升 LAL 试剂水。轻轻打旋每个组成30 秒，避免起泡。再造裂解液如果存储在-20 C，可以保持稳定一周，不推荐tonger 存储。避免反复冻融。Page 2继续 ToxinSensor 显色 LAL 内毒素检测试剂盒显色底物重建衬底 加入1.7 毫升 LAL 试剂水浓度 至 2 mM。一旦重建，底物溶液存储 在2-8 c可以保持稳定一个月。防止底物溶液长时间直接接触光。终止液重组颜色稳定剂 #1 （终止液） 用 10 毫升的缓冲液。重组终止液如果存储在 2-8 c可以保持稳定一周。重组颜色稳定剂 #2 和 #3 : 每个添加 10 ml LAL 水。每个重组液在 2-8 c下可以保持稳定一周。 标准内毒素的溶液此试剂盒中提供的冻干的内毒素标准量应参考内毒素标准液瓶上的标签。加 2ml的 LAL 试剂水溶解冻干的内毒素。涡漩充分混匀 15 分钟以获得内毒素贮备液。重组后的内毒素贮备液若存储在 2-8 C可保持稳定一周请不要冻结内毒素贮备液。Page3 II。试剂制备，继续准备 1 EU/ml 内毒素溶液，使标准系列稀释。在每个实验中，至少四个覆盖所需浓度范围的内毒素标准溶液以备生成的标准曲线。即如果试验样品的内毒素浓度预计范围内在 0.01-01 EU/ml,系列内毒素标准溶液可分别是 0.1、0.05、 0.025 和 0.01 EU/ml。下图概述了示例系列内毒素标准溶液的制备。每份溶液应该彻底的 30 秒内涡流混合。0.3 毫升 0.2 毫升 1 试剂 B B 8 B 0.1EU / ml 0力5EU/ml 0.025EU / ml 0.01EU / mt 最后内毒素浓度三。测试程序 1。小心地分配 100pl 标准品、 样品和LAL水到不同无内毒素viais上并标记它们作为标准 1，2，3，4，样品 1.2等和空白组。样品应用旋涡混合器彻底混合30 秒。避免起泡Page4三。测试程序，继续的 2。添加 100 pl重组 LAL到每个瓶子 。通过打旋盖住 Qsntly wals 和 tnix wsli。3.如果样品的预期的内毒素浓度范围为 0.01-0.1 EU/ml，水浴或加热封闭至T1，在 37 C1C下， 孵育架子上所有瓶。如果内毒素浓度范围内的 0.1-1EU/ml ，使用水浴或加热封闭至 T2，在 37 C1 C孵化 。注 T1 范围从 40 到 60 分钟和 T2 范围从 8 至 16 分钟。T1 和 T2 的最优值应该参考瓶上的标签。4.经过适当的孵化，添加 100 pt 的重组底物显色液到每个小瓶。通过漩涡轻轻混匀。不要动摇或反转涡以避免起泡，然后在 37 C1 C ，使用水浴或加热封闭，孵育 6 分钟。5.添加 500 pl 的重组终止液（颜色稳定剂 #1） 到每个小瓶和轻轻地漩涡搅拌均匀。不要动摇或反转涡以避免起泡。然后添加 500 pl 的颜色-稳定剂 #2，到每个小瓶，混合均匀。最后将 500 pl重组颜色-稳定剂 #3 添加到每个小瓶。每小瓶轻轻地漩涡混合均匀 3 秒。避免起泡。6.读的每个反应在 545nm的 吸光度。以蒸馏水为空白对照，调整光度计到零 吸光度Page51 协议，继续定量检测协议，继续 ToxinSensor 显色 LAL 内毒素检测试剂盒，继续整个测试过程概述于下表 标准样品标准样品 （毫升） 0.1 （毫升） LAL 试剂水 （毫升） LAL （毫升） 0.1 0.1 混合贴边和孵化在 37 C 1.0 C T1 或 T2 T1 或 T2 基板解决方案 （毫升） 0.1 0.1 混合贴边和孵化在 37 C 1.0 C (min) 6 停止解决方案 （毫升） 0.5 0.5 颜色-稳定剂 #2 (ml) 0.50.5 颜色稳定剂 #3 （毫升） 0.5 0.5 空白 0.1 0.1 T1 orT2 0.1 6 0.5 0.5 0.5 混合贴边并读取吸光度在 545 nm 四。浓度计算：在标准条件下的，545 nm 处的吸光度显示与浓度成线性关系，在 0.01-0.1 EU/ml 和 0.1-1EU/ml两个范围内。绘制 x 轴上的四个标准及在 y 轴上相应的内毒素浓度的吸光度点。绘制这些点之间的最佳拟合的直线和图形计算样品的内毒素浓度。示例使用下面的数据 样品 吸光度在 545nm & 吸光度LAL试剂水（空白）.Page6如果样品的平均吸光度是 x，样品的内毒素浓度将为0.2618x - 0.0012 EU/mt.所有孵化进行 45 分钟。以上的图是只示例曲线 ，标准的 OD 值随不同的检测方法而不同。注意 稀释标准和孵化温度将是可以影响的吸收值的关键的因素，它是重要的是确保内毒素充分溶解的标准，而且孵化温度须严格保持在 37 C1C。5. 性能特征线性用于测量内毒素值浓度范围内的标准曲线的线性度必须验证。至少4个超过预期的浓度范围的内毒素标准品，应与一个空白组同检测，一式两份。标准个体平均吸光度绝对值系数 (r) 与他们相应的内毒素浓度的标准应该是相关的、Page7产生废品的原因 检测试剂盒，产生废品的原因 复制样品应该用于建立良好的技术和低变异系数。 变异系数（C.V.）等于 100 倍的一组数据的标准差除以平均值的标准偏差，以百分比表示。 C.V.吸光度应小于 10%。6. 疑难解答可能因为。没有线性内毒素标准品没有混匀充分。内毒素可能附着于玻璃的表面。我们建议用 2 毫升 LAL试剂水溶解 冻干的内毒素标准品，如议定书中所述（步骤 1 中的测试程序