仙客来组织培养的研究.doc

仙客来组织培养的研究摘要目前，仙客来繁殖多用种子进行繁殖，且种子多为杂交种，不利于优良性状的保持。组织培养能够保持植物的优良性状并且有很高的繁殖率。对仙客来组织培养培养基配方的研究具有很高的基础理论价值和商业价值。利用组织培养的方法建立优系仙客来的无性繁殖体系，进行种苗的工厂化育苗生产，具有恢复和保持种性、快速大量繁殖优系品种的优势，可以从根本上解决仙客来生产上的种苗质量问题。本试验以仙客来“国旗红”为研究对象，通过不同消毒时间处理仙客来叶片，确定最佳的消毒时间。通过加入不同的激素处理，筛选适宜的诱导培养基；比较活性炭和抗坏血酸两种方法哪种方法可以更好的防止仙客来褐化。用升汞消毒6分钟时污染率最低；培养基MS+BA 2mg/L +NAA 1mg/L为诱导叶片形成愈伤组织的最佳培养基；MS+NAA mg/l + BA4 mg/l为愈伤组织的最佳增殖培养基。加入200mg/L的抗坏血酸可以有效防止外植体褐化。关键词：仙客来； 组织培养； 褐化； 增殖AbstractAt present, Cyclamen persicum Mill the reproduction multipurpose seed carries on the reproduction, also the seed are many is a hybrid, is disadvantageous to the fine character maintenance. The tissue culture can maintain the plant the fine character and to have the very high reproduction rate. Has the very high basic theory value and the commercial value to Cyclamen persicum Mill the tissue culture base for mule research.Establishes superior is Cyclamen persicum Mill the vegetative reproduction systemusing the tissue culture method, carries on the seedling the factorization to grow seedlings the production, has restores and maintains plants the nature fast, massively reproduces superiorly is the variety superiority, may fundamentally solve Cyclamen persicum Mill in the production seedling quality problem.This experiment is red take Cyclamen persicum Mill the national flag as the research object, through the different disinfection time processing Cyclamen persicum Mill leaf blade, determines the best disinfection time. Through joins different hormone processing, the induction culture medium which screening is suitable; Better prevent brown Cyclamen persicum Mill compared with the activated charcoal and may the antics or buticacid two methods which method.Disinfects 6 minutes time pollution with the mercuric chloride rate to be lowest; Culture medium MS+BA 2mg/L +NAA 1mg/L is the induction injuries the organization the best culture medium. In MS+NAA mg/l +BA4 mg/l is the best multiplication culture medium. Joins 200mg/L the ant is scorbutic acid to be allowed effectively out side to prevent plants the body brown.Key words: Cyclamen persicum Mill; Tissue culture; Brown; Multiplication前 言植物组织培养即植物无菌培养技术，是根据植物细胞全能性理论，利用植物体离体的器官、组织或细胞，如根、茎、叶、花、果实、种子、胚、胚珠、子房、花药、花粉以及贮藏器官的薄壁组织、维管束组织等，在无菌和适宜的人工培养基及光照、温度等条件下，能诱导出愈伤组织（原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组培中则指人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞）、不定芽、不定根，最后形成完整的植株1。至今，世界各国在无性系繁殖、花卉育种、植株脱病毒和种质保存等方面，广泛应用组织培养技术。1 组织培养1.1 植物组织培养机理正常植物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因和潜在能力，从理论上讲，植物体的每一个活细胞都应该具有全能性2。而植物组织培养不仅可以体现这一特点，并且可以保持植物提的修良性状。现在已广泛应用于植物体的大量繁殖上。植物细胞要表现出全能性，有两种途径：成熟细胞分生细胞胚状体完整植株成熟细胞愈伤组织出根出芽完整植株3 1.2 植物组织培养的意义及特点1.2.1 意义：快速繁殖优良品种、优良类型和珍贵种质资源。脱除各类病毒，幼化复壮植物4。有效的培养新品种，创造新型植物种类。采用组织培养可以直接诱变和筛选出具抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种。保存种质资源，避免基因的丢失和毁灭。提供加工原材料，生产次生代谢物。如抗癌首选药物-紫杉醇等，可以用大规模培养植物细胞来直接生产5。基因工程，基因工程主要研究DNA的转导，而基因转导后必须通过组织培养途径才能实现植株再生。1.2.2 特点：培养条件可以人为控制：组织培养采用的植物材料完全是在人为提供的培养基质和小气候环境条件下进行生长，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产。生长周期短，繁殖率高6。植物组织培养是由于人为控制培养条件，根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快7。另外，植株也比较小，往往2030d为一个周期。所以，虽然植物组织培养需要一定设备及能源消耗，但由于植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。8 管理方便，利于工厂化生产和自动化控制。植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件，既利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产9。它是未来农业工厂化育苗的发展方向。它与盆栽、田间栽培等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫害等一系列繁杂劳动，可以大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。2 仙客来简介2.1 仙客来的形态学特征仙客来(Cyclamen persicum Mill)为报春花科仙客来属植物。 仙客来为多年生草本10。块茎扁球形，深褐色。叶心脏形，叶面绿色，有白色斑纹，叶背紫红色，叶缘锯齿状11。花单生，下垂，花瓣向上翻卷，花梗细长，顶生一花有白、红、紫、橙红、橙黄以及红边白心、深红斑点、花边、皱边和重瓣状等品种，有的还带芳香。果实球形，种子褐色12。2.2 仙客来的地理分布仙客来是原产于北非、南欧和西亚，以地中海沿岸分布较集中13。我国引入仙客来看是栽培的时间大约在20世纪二三十年代，是从日本带入我国的，当时的栽培量还很少14。50年代初在北京、天津、青岛、上海等地开始了栽培育种方面的研究工作15。进入80年代后开始广泛从国外引进品种，使仙客来的品种很快增加，栽培数量和范围也得到迅速发展。以天津和浙江的仙客来研究最为出色。2.3 仙客来的生物学特性喜凉爽气候和腐殖质丰富的砂质土壤。酸碱度要求中性，如酸度偏大（小于pH55），幼苗生长会受到抑制16。不耐炎热，夏季温度在30以上，球茎被迫休眠，超过35，易受热腐烂，甚至死亡17。生长适温为1220。冬季温度低于10，花朵易凋谢，花色暗淡，5以下，球茎易遭冻害。仙客来喜湿润，但积水。喜光，但忌强光直射，若光线不足，叶子徒长，花色不正。仙客来花期长，南京地区15月，青岛地区10月能见初花18。2年生球茎可开花10朵以上，45年生球茎能开花上百朵。2.4 仙客来的繁殖方法仙客来一般用播种繁殖，也可用球茎分割法繁殖19。近年来，国外已成功地采用叶扦插法和组织培养法繁殖仙客来20。目前，已用幼苗子叶、叶柄、块茎和根为材料，进行组培和规模性生产。2.5 仙客来的观赏价值与应用 心型的叶片上有心型的花纹，叶片本身的观赏价值较高，花姿奇异，色彩绚丽，洒脱飘逸21。盛开的仙客来一簇一簇地集中在一起，周围围绕着旺盛的叶子，很具观赏价值。特别是它开放在百花凋零的冬春季节，使圣诞节和春节首选盆花。仙客来的养护简单，适合北方的气候，既可观花又可观叶22。仙客来一直打欧式馈赠亲友用于室内布置的佳品23。它可以用来布置房间、客厅，或放置于画家，或点缀案头，都能增添不少情趣。仙客来花期较长，也可作切花材料瓶插观赏。在南方凉爽季节也可用来组成花坛或配置在绿地、庭院中，是很有发展潜力的植物。3 仙客来组织培养的研究进展从二十世纪50年代开始即有关仙客来组织培养的报道，主要是美国和日本的科学家在实验室内的试验研究24。日本从80年代开始投入了一定的力量进行了研究和开发，做了大量工作，在培养的取材部位、灭菌方法等方面取得了明显的进展，并利用黄化叶柄和球茎等部位均能培育出组培苗25。从50年代到80年代有关文献的报道表明，利用仙客来的块茎、叶片和叶柄均能够产生出愈伤组织、茎芽、类似块茎和根的结构18。比利时的科学家Willy Dillen等1996年第一次比较详细的报道了利用仙客来开花后成苗叶片的组织培养快繁体系的建立，进行了适宜的愈伤组织类型的选择研究，获得了一定数量的再生植株并生长开花26。1999年约旦科学家对野生仙客来进行了保存利用野生种质资源为目的的组织培养的研究。我国的仙客来组织培养研究从80年代开始，傅新生等在1985年最早发表了一篇关于以成苗叶片为外植体诱导愈伤组织的产生的简报27。之后，侯喜林等在1991年主要以实生苗的黄化叶柄为外植体，比较了此方法在内生菌的污染率、不定芽诱导率、生根率与普通叶柄的差异，取得了较为理想的结果28。张敬方等在1992年报道利用仙客来叶片、叶柄作为外植体，筛选出最佳的初代培养基，同时也筛选出试管苗的生根配方29。庞基良、林波等于1994年研究了激素、光照对仙客来叶片愈伤组织诱导、分化及试管苗生长的影响。 4 本试验的目的意义目前，仙客来繁殖多用种子进行繁殖，且种子多为杂交种，不利于优良性状的保持。组织培养能够保持植物的优良性状并且有很高的繁殖率30。对仙客来组织培养培养基配方的研究具有很高的基础理论价值和商业价值。利用组织培养的方法建立优系仙客来的无性繁殖体系，进行种苗的工厂化育苗生产，具有恢复和保持种性、快速大量繁殖优系品种的优势，可以从根本上解决仙客来生产上的种苗质量问题。本试验的目的是通过试验揭示建立仙客来离体培养的无菌体系。确定仙客来叶片离体培养的适宜诱导培养基。解决仙客来叶片离体培养的褐化问题。找到仙客来叶片离体培养的有效增殖方法。本文的结果可以为探索仙客来组织培养新技术，解决仙客来组织培养技术难题，促进仙客来在我国的生产和利用起到一定的借鉴作用。1 材料与方法1.1 试验材料 采用仙客来“国旗红”品种的幼嫩叶片为外植体。1.2 试验方法1.2.1 外植体不同消毒时间的处理配制MS培养基加蔗糖30g/L，琼脂7 g/L，调节PH值5.8-6.2，并将其分装、封口，和接种用的实验器具一起进行高压灭菌后接种。本试验采用酒精表面灭菌和升汞进行接种前的消毒处理。采取消毒时间为四个梯度：2min，4min，6min，8min，将叶片分组分别进行不同时间消毒处理。将处理后的叶片切成1*1cm的小块接种到培养基上。一个月后统计，外植体不同消毒时间后的褐化率、污染率、成活率 ，比较得出最佳消毒时间t。重复3次，取平均值。1.2.2 适宜培养基的筛选1.2.2.1 NAA的筛选 配制MS培养基加蔗糖30g/L，琼脂7 g/L，在添加2 mg/L BA的MS培养基中添加不同浓度梯度的NAA：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/L，调节PH值5.8-6.2，并将其分装、封口。和接种用的实验器具一起进行高压灭菌后接种。利用试验1.2.1中得出的最佳消毒时间t进行接种前灭菌。将处理后的叶片切成1*1cm的小块接种到培养基上。一个月后统计愈伤组织诱导率，根据外植体的生长情况确定最佳的NAA浓度。重复3次，取平均值。1.2.2.2 BA的筛选在试验1.2.2.1筛选出的最佳NAA浓度的培养基中添加不同浓度梯度的BA：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L，调节PH值5.8-6.2，并将其分装、封口，和接种用的实验器具一起进行高压灭菌后接种。 利用试验1.2.1中得出的最佳消毒时间t进行接种前灭菌。将处理后的叶片切成1*1cm的小块接种到培养基上。一个月后统计愈伤组织诱导率，根据外植体的生长情况确定最佳的BA浓度。重复3次，取平均值。1.2.3 增殖培养仍以MS为基本培养基，添加三种组合的激素，分别添加NAA1 mg/L，BA2 mg/L，NAA 1mg/L，BA4 mg/L和NAA 1mg/L，BA8 mg/L，将诱导出的愈伤组织分切成大小一致的小块接入培养基。3次重复，取平均值，并比较三种培养基中愈伤组织增殖情况。1.2.4 抗褐化的处理1.2.4.1 抗坏血酸抗褐化利用抗坏血酸的抗氧化作用来减少褐化。在试验筛选出的NAA，BA的最佳浓度的培养基中分别加入0、50、100、150、200、250 mg/L， 调节PH值5.8-6.2，以空白为对比，并将其分装、封口，和接种用的实验器具一起进行高压灭菌后接种。将灭菌处理后的叶片切成1*1cm的小块接种到培养基上。一个月后统计，根据统计的褐化情况和愈伤组织生长情况来比较确定最合适的抗坏血酸浓度。3次重复取平均值。1.2.4.2 活性碳抗褐化利用活性碳的吸附作用来减少褐化。在试验筛选出的NAA，BA的最佳浓度的培养基中分别加入0、2、4、6、8g/L的活性炭， 调节PH值5.8-6.2，以空白为对比，并将其分装、封口。和接种用的实验器具一起进行高压灭菌后接种。将灭菌处理后的叶片切成1*1cm的小块接种到培养基上。一个月后统计，根据统计的褐化情况和愈伤组织生长情况来确定最合适的活性炭浓度。3次重复取平均值。2 结果与分析2.1 外植体不同时间的处理表1 外植体不同时间的处理消毒时间（min）接种瓶数污染瓶数污染率（%）褐化瓶数褐化率（%）成活瓶数成活率（%）2302686.7125.0413.34301963.3436.41136.76301136.7842.11963.383026.7150.026.7从表1可以看出,升汞的消毒时间对外植体灭菌发挥了明显的作用,随着消毒时间的增加,污染率降低。叶片用升汞消毒2min、4min、6min、8min,污染率分别为86.7%、63.3%、36.7%和6.7%。从表1还可以看出,外植体的褐化与升汞的消毒时间密切相关,升汞处理时间为2min、4min、6min、8min,褐化率分别为25.0%、36.4%、42.1%、50.0%，可见,随着消毒时间的延长,污染率下降，但是褐化率却升高。图1 不同消毒时间处理对外植体形成愈伤组织成活率的影响从图1中可以看出，不同消毒时间处理对外植体形成愈伤组织的成活率的影响，随时间的增加而逐渐上升。当时间达到8min时，由于消毒时间过长，消毒剂不仅杀死了细菌同时也杀死了正常的植物细胞。图2 消毒时间为4min时，形成愈伤组织的图片 图3消毒时间为6min时，形成愈伤组织的图片2.2 NAA的筛选表2 愈伤组织诱导成功率NAA mg/L愈伤组织诱导率013.50.543.71.072.51.545.62.048.12.519.4图4 愈伤组织诱导成功率由于BA是植物形成愈伤组织的必须激素，所以在固定了BA的浓度时，由表2、图4可以看出当NAA浓度为0时，愈伤组织也是生长的，不过成功率不高13.5%。在NAA浓度为1mg/L时，愈伤组织诱导率达到最大值72.5%，效果也最明显。2.3 BA的筛选表3 愈伤组织诱导成功率BA mg/L愈伤组织诱导率012.30.525.41.042.61.553.82.060.92.549.9 图5 愈伤组织诱导成功率在固定了NAA的浓度为1.0时，由表3、图5可以看出当BA浓度为0时，愈伤组织也是生长的，不过成功率非常小12.3%。在BA浓度为2.0mg/L时，诱导愈伤组织的成功率达到最大值60.9%，效果也最明显。小结：由上诉结论可以看出当NAA浓度为1.0，BA浓度为2.0时，愈伤组织诱导率最大，为仙客来组织培养基的最佳诱导配方。2.4 增殖培养表4 愈伤组织增值NAA mg/lBAmg/l2 mg/l4mg/l8 mg/l1 mg/l增值率40.8%褐化率28.3%增值率62.3%褐化率35.7%增值率72.9%褐化率54.2% 实验结果表明：随着BA浓度的增大，愈伤组织的增值率越大达到最大值72.9%；由表4还可以看出随着BA浓度的增大，褐化率也不断的增大由最初的28.3%上升54.2%。2.5 不同处理对褐化率的影响 分组 图6 以组为单位比较褐化率由图6可以看出活性炭组分的褐化率不仅不稳定波动比较大而且褐化率较高。而抗坏血酸的褐化比较稳定几乎呈下降的趋势，当抗坏血酸浓度为2.0mg/l时褐化率最低为41.2%。究其原因，可能是因为活性炭溶解力小，形成固体培养基的时候浓度不均匀。有待于近一步证实。3 结论与讨论3.1 不同消毒时间处理在组织培养中,外植体接种是组培的前提条件。消毒时间对外植体的接种成功与否具有明显的影响。因此,应当选择适宜的处理时间,以尽量减少植物组织的死亡。仙客来组织培养中的最佳消毒时间为6分钟。当消毒为8分钟时，虽然菌类已经彻底消除，但是正常的植物细胞也大部分被杀死，不能形成愈伤组织。3.2 诱导愈伤组织的激素的选择 植物激素与植物的生长有密切关系，其中在生长过程中生长素类和细胞分裂素类是两种最主要。植物的生长主要包括细胞体积的扩大和数量的增多。因此确定添加BA（细胞分裂的作用）和NAA（细胞生长的作用），两种都是人工合成的类似于植物激素的植物生长物质。在组织培养中，植物生长物质对植物外植体生长有促进作用，但都是微量的，具体用量视诱导目的不同而定。当培养基为MS+BA 2mg/L +NAA 1mg/L时愈伤组织诱导最大，并且褐化率也比较低，量过大虽然诱导率更大，但褐化率太高，不利于愈伤组织的再次生长。3.3 增殖培养在增殖培养中，认为细胞分裂素是主要的，因此，本实验只对BA的量进行了变化，NAA仍用诱导愈伤组织时的量。比较三种激素配方，当BA浓度达到8mg/l时，愈伤组织增值率最大72.9%，但褐化率也达到最大值52.4%，随着BA浓度的增大，褐化率也随之增大。所以综合考虑当培养基配方为MS+NAA mg/l + BA4 mg/l增殖效果最佳,作为仙客来组织培养的最佳增殖配方。3.4 不同处理对褐化率的影响 在组织培养过程中，部分外植体会产生褐化现象。这主要是由多酚氧化酶作用于天然底物酚类物质而引起的，一般认为，在自然条件下，酚氧化酶和其底物处在正常组织内的不同部位，细胞中的酚和醌之间保持一种动态平衡，醌类物质水平较低；31当细胞受伤或衰老时，酚氧化酶释放或合成，在合适的PH、温度等条件下，酚氧化酶、酚类（底物）和氧气聚合发生氧化反应，形成有毒有醌类物质。32所以，被切割的外植体在接种后，切面细胞中酚类物质被氧化成醌，致使切面迅速变成棕褐色或暗褐色，这些褐色物会逐渐扩散到培养基中，抑制细胞内其它酶的活性，毒害整个外植体组织，从而影响愈伤组织的形成。影响组培外植体褐变的因子主要有：外植体酚类物质的含量、PPO活性上的差异、外植体的大小、培养基的成份、激素类型。32在植物组织培养中，一般都是从培养基的组成，如培养基的无机盐成份、蔗糖浓度、添加的激素的种类和浓度、加入吸附剂活性炭或PVP（聚乙烯吡咯烷酮）等来防治外植体褐化。通过实验数据分析，抗坏血酸的抗褐化效果比活性炭的效果好；不仅因为抗坏血酸的褐化率比较稳定，而且抗坏血酸的溶解力比活性炭强，效果比较均匀稳定。参考文献1马翠萍，孙仲序，赵春芝，等.植物组培污染防治研究概况.生物技术.2002，12（4）：46-47.2李季凤，胡国富，胡宝忠.11种不同花色一串红组织培养快繁的研究.生物技术.2005，15（4）：71-73. 3曲复宁，由翠荣，宫雪琴.仙客来无性繁殖体系建立中不定芽分化能力的数量分析北方园艺2002, (5): 62-63.4陈俊愉.中国农业百科全书一观赏园艺卷.农业出版社 (北京). 1996：15-29.5谭文橙观赏植物组织培养技术中国农业出版社（北京）1991：45-46.6李会宁仙客来的离体无性试管繁殖研究氨基酸和生物资源2001, 23 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