PCR技术及其发展和应用.ppt

PCR技术及其发展和应用 主要参考书 CW迪芬巴赫 GS德弗克斯勒 美 主编 PCR技术实验指南 黄留玉主编 PCR最新技术原理 方法及应用 尹一兵主编 分子诊断学 多聚酶链反应技术 polymerasechainreaction PCR PCR技术的原理PCR技术的衍生技术实时荧光PCR技术PCR技术的应用 PCR技术简史 核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR的完善 PCR技术的基本原理 重复1 3步25 30轮 目的DNA片段扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链与引物复性 DNA变性形成2条单链 子链延伸DNA加倍 MOVIE PCR反应过程PCR的特点PCR的操作步骤 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 模板DNA PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 引物1 引物2 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 引物1 引物2 Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 第1轮结束 第2轮开始 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 第2轮结束 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 理想拷贝数 2nn循环次数实际拷贝数 1 x nX平均效率 约为0 85n循环次数 PCR技术简史 核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR的完善 PCR技术简史 核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR的完善 1985年 美国PE Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应 PCR 实现了在试管中模拟细胞内的DNA复制 然而 采用E coliDNA聚合酶进行PCR 由于该酶不耐热 使这一过程耗时 费力 且易出错 PCR技术简史 核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR的完善 1988年初 Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR 其扩增的DNA片段很均一 特异性 真实性也较高 但每循环一次 仍需加入新酶 1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 thermusaquaticus 中提取到一种耐热DNA聚合酶 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行 随后PE Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪 PCR技术的基本原理 PCR反应过程PCR的特点PCR的操作步骤 PCR技术的基本原理 PCR反应过程PCR的特点PCR的操作步骤 PCR技术的基本原理 PCR反应过程PCR的特点PCR的操作步骤 设置反应程序 1 94 变性5min 2 94 变性1min 3 52 退火1min 4 72 延伸1min 5 72 延伸10min 重复 2 4 30次 PCR结果 1 对照 无模板 2 6 PCR产物 5ul样品 PCR产物的电泳鉴定 1 模板单 双链DNA均可 多种来源 质量要求不高 但不能混有蛋白酶 核酸酶 DNA聚合酶抑制剂 DNA结合蛋白类 一般人基因组100ngDNA模板 100 L 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加 PCR反应的影响因素1 反应体系 LambdaDNA 模板量分别为100pg 10pg 1pg 100fg 10fg 2 引物引物是与待扩增DNA片断两翼互补的一段特异的寡核苷酸片断 引物是PCR反应中最关键的因素 因此引物序列的设计对于PCR是否成功是非常重要的 1 引物长度 以18 24bp为宜 2 碱基均衡分布 四种碱基尽可能随机分布 G C占40 60 上下游引物应基本一致 3 避免形成二级结构 发夹结构 二聚体 4 引物的两端 3 端为关键碱基 5 端无严格限制 引物设计的原则 3 5 3 5 限制性内切酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记 5 引物的特异性 引物序列应避免在模板内有较高相似性的系列 尤其是3 末端 可以在www ncbi nih blast cgi进行在线比较通过OMIGA ClustalX等软件进行两两或多序列的比较 引物序列同源性比对 引物设计 引物设计常用软件主要有 PrimerPremier5 0Oligo6primer3ThePrimerGeneratorNetPrimer 1 将序列输入软件中 两个方法 2 打开原有的序列文件 在对话框中输入待扩增序列点击左上角的 Primer 按钮 2 设置相关参数 3 得到的引物结果 Hairpin 引物自身是否会形成发夹结构Dimer 同一种引物是否会形成二聚体Falseprimiring 引物在待扩增序列中其他位置是否有配对CrossDimer 正向与反向引物间是否会形成二聚体 改动后引物的信息 重新回到双引物的界面 Edit Copy SensePrimer 5 CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA3 4 输出引物序列 引物纯度 公司合成引物常用的纯化方式C18脱盐 OPC纯化 PAGE纯化 HPLC纯化 普通PCR OPC纯 95 较长引物 大于50个碱基 PAGE纯 95 经过修饰或标记的引物 HPLC纯 99 但价格昂贵 引物浓度 0 1 0 5 mol L 浓度过高易导致模板与引物错配 反应特异性下降 生物科技有限公司的引物合成服务 3 耐热DNA聚合酶 1 TaqDNA聚合酶 Taqpolymerase 95 的半寿期为40min最适温度 72 时每个酶分子每秒可催化合成150个核苷酸酶活性 受多种因素影响 5 3 方向的聚合酶活性 5 3 方向的外切酶活性和逆转录酶活性 非模板依赖性活性 可在双链PCR产物每一条链的3 端加上单核苷酸尾 使PCR产物的3 端突出一个单A核苷酸尾 TthDNA聚合酶 在高温和MnCl2存在的条件下 能有效地逆转录RNA 用于一步法RT PCR VentDNA聚合酶 又称TliDNA聚合酶 该酶耐高温且具有3 5 外切酶活性的校对功能 其保真性较TaqDNA聚合酶高一倍 该酶扩增长片断 12kb 的功能较强 PfuDNA聚合酶 具有3 5 外切酶活性的校对功能 催化DNA合成的忠实性比Taq聚合酶高12倍 但不适于 2kb的片断扩增 2 其他的耐热聚合酶 4 dNTP四种dNTP浓度应相等dNTP浓度 100 200 mol L浓度过高 影响DNA聚合酶的活性 且易产生错误碱基的掺入浓度过低则降低反应产量 UNG酶可降解dUTP替代扩增产物 5 Mg2 Mg2 是DNA聚合酶的激活剂 0 5mmol L 2 5mmol L反应体系 dNTP EDTA等负离子的浓度影响反应中游离的Mg2 浓度 Mg2 浓度过低会使Taq酶活性丧失 PCR产量下降 Mg2 过高影响反应特异性 2 循环参数变性使双链DNA解链为单链95oC20 30秒 2 退火温度由引物长度和GC含量决定 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合 降低温度可增加反应的灵敏性 3 延伸70 75oC 延伸时间由扩增片段长度决定 4 循环次数主要取决于模板DNA的浓度一般为25 35次次数过多 扩增效率降低 错误掺入率增加 二 PCR的衍生技术 逆转录PCR reversetranscriptionPCR RT PCR 反向PCR inversePCR 巢氏PCR nestingPCR 原位PCR insituPCR 多重PCR multiplexPCR 多重等位基因PCR multiplexallelePCR 不对称PCR asymmertricPCR 锚定PCR anchoredPCR 长片段PCR longfragmentPCR 荧光定量PCR fluorescentquantitativePCR 逆转录酶 DNA聚合酶活性 mRNA cDNA 杂化双链 PCR扩增 1 逆转录PCR reversetranscription PCR RT PCR 影响因素 1 模板对RT PCR的影响对RNA制品的纯度和完整性要求都极为严格 2 逆转录酶对RT PCR的影响MLV逆转录酶能合成大于2kb的较长cDNA 但对热的稳定性较AMV逆转录酶差 3 逆转录引物对RT PCR的影响随机引物 原核细胞多用oligo dT 真核细胞多用基因特异性的引物 GSP 特异性强 广谱性低 例子 S pn的转化对PsaA基因mRNA表达的影响 a RNA的提取 野生型和转化缺陷型S pn都诱导转化后 采用Qiagen试剂盒进行总RNA提取 b cDNA的制备 取RNA2 l 随机引物1 l DEPC水9 l 混匀后 70 变性5min 立即置于冰上 然后顺序加入逆转录buffer5 l dNTP1 5 l RNasin0 5 l DEPC水5 l 逆转录酶M MLV1 l 混匀后于37 1小时 得到cDNA c PCR扩增 PsaA的引物3 L cDNA1 L Tagplus酶0 2 L 共30 L体系 循环参数 94 30秒 55 40秒 72 45秒 循环30次 用16srRNA的PCR产物为标准物 2 琼脂糖电泳 电泳结果用软件Quantity one3 2进行半定量比较 结果进行配对t检验分析 16S 463bp PsaA 254bp 图2 2号菌株及其转化缺陷菌株在加入CSP后的不同时间PsaAmRNA的表达 1234567 图1 2号菌株及其转化缺陷菌株在加入CSP后的不同时间PsaA的RT PCR电泳图 line1 Marker2 line2 4 0min 10min 20minafterS pneumoniaeNo 2wasaddedCSP line5 7 0min 10min 20minafterS pneumoniaeNo 2dwasaddedCSP 2 反向PCR inversePCR 用反向的引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增 应用 1 用于测序的DNA大片段的克隆 2 获得启动子序列 3 小质粒的定点突变 4 鉴定插入失活基因或体内诱导基因 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 连接酶 反向PCR示意图 转化到大肠杆菌后 提取质粒 采用质粒引物即可直接对X片断进行扩增后测序 得到X基因序列信息 10 64 例子 S pn体内诱导基因序列的获得 3 多重PCR multiplexPCR 用于检测特定基因序列的存在或缺失 电泳 引物 2020 3 18 54 可编辑 图1第1 2 3组引物多重PCR电泳图1 正常对照 2 DL2000marker 3 10 检出的缺失型患者 杜氏 贝克型肌营养不良症 一种常见的致死性神经 肌肉系统的X连锁隐性遗传病 其基因突变中缺失最常见 约占55 65 缺失分布的位点较多 随地域及民族的差异而有不同特点 4 突变PCR 1 随机突变 应用 构建突变体文库 继而可从中筛选出具有特殊性质的突变个体策略 易错PCR error pronePCR 利用TaqDNA聚合酶等耐热DNA聚合酶不具有3 5 校对功能的特性 在PCR扩增反应中可能掺入错误的核苷酸 从而产生随机错误的扩增产物 加入次黄嘌呤核苷酸并限制某一种核苷酸的用量 从而促进DNA聚合酶选择其它3种核苷酸或次黄嘌呤核苷酸 导致扩增产物发生突变 2 定点突变 1 5 端引入突变 通过修饰上游引物的5 端 即可引入标记的碱基 限制性酶切位点 启动子序列等 2 序列中的单位点突变 采用重叠延伸PCR OverlapExtensionPCR OEPCR A 为5 端引入突变 B 为单碱基突变 例子 S pn的ply146aa缺失的突变序列构建 S Pn的ply为一细胞毒性分子 其146位aa缺失后毒性大大减弱 构建突变体作为疫苗 首先设计4个引物 M1和M2完全重叠 P1 5 CGGGATCCATGGCAAATAAAGCAGTAAATG 3 BamHIP2 5 CCGCTCGAGCAAGCATTCTCCTCTCCTAGTC 3 XhoIM1 5 GGTCAATAATGTCCCA AGAATGCAGTATG 3 M2 5 CATACTGCATTCT TGGGACATTATTGACC 3 以基因组DNA为模板 以P1和M1为引物扩增出ply上游片断 以P2和M2为引物扩增出ply下游片断以上下游片断为模板 以P1和P2为引物 扩出全长酶切后克隆到质粒中保存 3 多位点突变 策略 多次重叠PCR关键 重叠引物的设计 每对突变引物需要部分重叠 方向相反 5 原位PCR InSituPCR 原位PCR是由Hasse等于1990年首创 它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段 在不破坏细胞的前提下 利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增 可进行细胞内定位 适用于检测病理切片中含量较少的靶序列 操作步骤1 细胞或组织固定 细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂 包括引物和Taq酶 进入2 PCR扩增细胞内目的片段3 原位杂交检测扩增产物 A 阳性对照 B 阴性对照 C 原位检测mRNA表达 三 实时荧光PCR技术 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针 对PCR产物进行标记跟踪 实时在线监控反应过程 结合相应的软件可以对结果进行分析 计算待测样品的初始模板量 如何定量 Ct值的概念Ct值的定义 PCR扩增过程中 荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数 为什么要用Ct值定量实时荧光定量PCR方法利用循环阈值 Ct 的概念 在指数扩增的开始阶段进行检测 此时样品间的细小误差尚未放大 因此该Ct值具有极好的重复性 C t 值的重现性 相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图终点处检测产物量不恒定 C t 值具重现性 C t 与初始模板含量 初始模板量越多 C t 值越小C t 与初始模板浓度的对数值成线性关系 定量原理 初始DNA量越多 荧光达到某一值 域值 时所需要的循环数越少 Ct值 Log浓度与循环数呈线性关系 根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量 确定初始模板的浓度 1 荧光定量PCR标记方法内掺式染料SYBRGreenI序列特异性探针TaqmanMolecularBeaconsDualProbes FRET 引物特异性探针Amplifluor Intergen SYBR GreenI 1 内掺式染料 SYBR GreenI 优点 使用方便 不必设计复杂的引物没有序列特异性 可以用于不同的模板便宜灵敏 例子 荧光定量PCR检测肺炎链球菌comE基因转录水平 方法流程 1 标准品制备 普通PCR扩增出comE基因片断 装入克隆质粒 定量稀释为109拷贝作为标准品备用2 定量检测comE基因表达水平 提取RNA 逆转录成cDNA 与成10倍梯度稀释的标准品一起作为模板 同时进行荧光定量PCR 根据实验数据分析结果 得到其表达的绝对量 图1comE基因荧光定量PCR扩增曲线 图2comE基因荧光定量PCR融解曲线 表1D39菌株在CSP诱导后不同时间的comE基因mRNA表达 p 0 05 CSP诱导10min时comE的表达量较0min和20min时显著增高 实验结果 Oligo1 Fluorescein Oligo2 LCRed640 荧光共振能量传递 FRETProbe 2 序列特异性探针 双标记探针 TaqmanProbe 优点 对目标序列有很高的特异性 特别适合于SNP检测与MolecularBeacons相比设计相对简单是目前应用最广泛的一种技术 SNP检测 X 分子信标 MolecularBeaconProbe 引物特异性探针 AmplifluorProbe 3 引物特异性探针 2 荧光定量实时PCR与普通PCR的比较灵敏度高 荧光检测较电泳检测灵敏度高特异性高 引物和荧光探针定量准确 全程监控 准确的算法进行定量无需跑胶 自动化程度高封闭体系 环境污染少 4通道实时荧光定量PCR仪 3 荧光定量PCR仪荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪 通常配有电脑系统及相应的分析软件 韩健 iCubate分子诊断平台 靶序列富集多重PCR Tem PCR targetenrichedmultiplexPCR 具有兼容性 特异性 敏感性 半定量 灵活性 高效性适合于分子鉴别诊断方法的开发 PCR只是一个简单的不起眼玩艺 凯利 穆利斯 KaryMullis PCR只是一个概念 所发生的奇迹是 PCR概念变成了可操作的实验系统 变成了一项成熟的技术 后者又上升成为新的概念 它最大的特点就是能不断推出新形式 摘自 MakingPCR AStoryofBiotechnologybyPaulRabinow PCR技术的应用 研究与生产基因克隆 DNA测序 分析突变诊断细菌 病毒 寄生虫检测 肿瘤诊断法医犯罪现场标本分析其他 1 基因克隆 重组质粒 酶切 PCR扩增 染色体DNA 连接 基因工程产品 我国已批准生产的部分生物技术药物名称作用rhuEPO产生红细胞rhuIFN 1b 外用 病毒性角膜炎rhuIFN 1b乙肝 丙肝rhuIFN 2a乙肝 丙肝 疱疹等rhuIFN 2a 酵母 乙肝 丙肝rhuIFN 2b乙肝 丙肝白血病等rhuIFN 2a 栓剂 妇科病rhuIFN 2b 凝胶剂 疱疹等rhuIFN 类风湿人胰岛素糖尿病rhuG CSF刺激产生白细胞rhuGM CSF刺激产生白细胞 骨髓移植rhuGH矮小病乙肝疫苗预防乙肝rhuEGF 外用 烧伤 创伤EGF衍生物烧伤 创伤rhuIL2癌症辅助治疗rhuIL2125Ser癌症辅助治疗bFGF 外用 创伤 烧伤RSK溶血栓 心梗 抗IL28单抗乳膏剂银屑病痢疾疫苗预防痢疾 Sequencingbysynthesis Illumina Solexa readlength80 150bp 1G run 2 基因测序 PCR PCR 3 基因检测 A 内源性病变基因 正常人 A 病人 外源性基因 正常人 病人 地中海贫血症 扩增阻滞突变系统 amplificationrefractorymutationsystem ARMS 进行检测 1 内源性基因检测 遗传病的诊断 300bp 1000bp 800bp 图1 珠蛋白ARMS检测结果11 2分别为正常样本的N产物和M产物 3 5 7为检测样本的N产物 4 6 8为相应M产物 图2 珠蛋白ARMS检测结果21为N产物 2为M产物 对照产物861bp 囊性纤维化病 CF 镰刀型细胞贫血症 2 外源性基因检测 病原体的诊断 丙型肝炎病毒 HCV 感染的诊断 HBV感染的传统诊断主要采用免疫测定法检测血清标本中的HBSAg HbeAg 抗 Hbs 抗 HBc和抗 Hbe 两对半 免疫学方法虽然比较简单 但只能提供血清中的HBV间接证据 无法证明是否具有传染性 且敏感性较低 目前的荧光定量PCR方法多采用TaqMan探针 一般根据HBV基因中的高度保守序列来设计 能够检测少至10拷贝 mL的HBV