胶原蛋白和壳聚糖.docx

胶原蛋白和壳聚糖（CC）之间的分子相互作用有可能产生生物复合材料具有新颖性的潜力。通过粘度测定法，广角X射线散射和傅立叶我们特征在CC复合物的分子间的相互作用变换红外光谱。结果发现，CC处于之间的分子水平并表现出相互作用混溶组件; CC共混物的X射线衍射表明，该胶原螺旋结构丢失在CC薄膜随着脱乙酰壳多糖内容。与降低壳聚糖含量非线性viscometic行为被解释为一个第三结构相的证据形成为CC的复合物。胶原与脱乙酰壳多糖的混合给出了制造用于新预定的材料的可能性潜在的生物医学应用。胶原蛋白和甲壳素是其中最丰富的聚合物的生活。他们都有内在的属性提供强大的，但可操作脚手架结构在许多多细胞生物。胶原蛋白和壳聚糖（CC）（几丁质的更可溶的衍生物）不存在一起作为共混物的性质，但在特定的属性每个可用于生产人造共混物赋予独特的结构和机械性能。该使用成本相对较低，低污染的生物材料具有特殊性能具有巨大的潜力发展新一代假体植入物的。之一的脱乙酰壳多糖的最有前途的特征是其优异能力被加工成多孔结构在细胞移植和组织再生使用。一个研究人员的数量已经研究组织响应各种基于壳聚糖的植入物1-3。在一般情况下，这些材料已被发现唤起一个最小的国外的反应。在大多数情况下，没有大的纤维包封已观察4-6。医生和脱乙酰壳多糖的药物应用包括其绷带，海绵，薄膜，人工皮肤使用，隐形眼镜，控释药物，骨病治疗和手术缝合线.共混物的特性的一个重要方面是混溶性其组成部分。相容性聚合物混合物被分配给之间的特异性相互作用聚合物组分，它通常以一个产生尽管高的负混合自由能分子量的聚合物。最常见的在共混物的相互作用是：氢键，离子和偶极，对 - 电子和电荷转移配合物。大多数聚合物共混物是不溶混的彼此因缺少特异性相互作用，然而混合物胶原与合成和天然聚合物是的越来越多的关注科学家和技术专家9,10。CC的共混物已被用于聚合物的设计支架的体外培养人类表皮的癌细胞11，作为膜控释12-14中，并作为植入纤维15,16。的影响壳聚糖对物化和生化特性的胶原先前已17-20研究。它已经表明，脱乙酰壳多糖可修改属性胶原当生物或机械的属性被考虑。此外，形成CC之间的聚阴离子，阳离子复合物是观察到19。从上述内容，进一步物理和CC的结构特征是需要开发新型生物材料的属性，允许更的混溶性的影响广泛的表征分子水平。在研究中提出我们在这里有使用多种互补生物物理表征方法来生产更好地了解CC相互作用。2. Materials and methods我们从尾部的实验室获得胶原蛋白年轻的白鼠筋。简单地说，肌腱切除，并在蒸馏水中洗涤，并混合在一Waring混合器在0.5米乙酸，样品然后在Sorvall离心机和离心在10,000rpm下可溶部分倾析和冻干。壳聚糖（360,000分子量）自Fluka获得瑞士。聚合物共混物的制备通过混合在0.5米乙酸，使得适当量的CC一系列11溶液制备一式两份含胶原：脱乙酰壳多糖的共混物与最终浓度每升1克。解决方案制作的共混范围从100壳聚糖至100的胶原蛋白在10重量的贡献的间隔。聚合物薄膜被铸造解决方案上获得玻璃板或氟化钙分光窗户。 后溶剂蒸发，将样品在真空中干燥在室温下。胶原，壳聚糖粘度测量和胶原/壳聚糖混合物溶液以进行204 C在0.5M醋酸pH值2.7，使用石英乌氏粘度计。对于混溶性的计算由萍萍描述的步骤是使用了21。IR谱用分光光度计得到Mattson的创世纪II（美国）。所有光谱记录由吸收模式在4厘米？1时间间隔和16倍扫描。一个足够厚度的膜（典型地50毫米）被用来保证吸光度值在spectrophotometer-的最优线性范围内获得高达1AU中的波长范围内3200-1000厘米？1波数。广角X射线散射（WAXS）测量，该薄膜样品装入样品该NANOSTAR的室（布鲁克AXS，卡尔斯鲁厄）在斯特灵大学的X射线设备。 数据用于收集遵循的程序，在描述详细地弗兰克韦斯等。 22。散射截面拍摄使用样品到检测器的距离在3小时的暴露4.5厘米。收集的数据被用于相机畸变校正，背景图像中减去，和图像利用内部软件进行分析。二维检测器输出被转换成一维型材，准备用于分析。主成分分析（PCA）受雇于为数据的详细检查。数学依据PCA得到了很好的证明23-30。 PCA旋转原始数据转换成一组新的轴，使得前几个轴反映了大部分的变化中数据。通过绘制这些轴上的数据，主要下层结构可以自动发现。PCA生成基函数解释的性质在数据的方差。有尽可能多的基础作为有初始变量，它们是排序从大到小依次重要性，作为决定由其相关的特征值。3. Results and discussion用于表征的分析技术的CC共混物的相互作用描述如下。3.1。 X射线衍射CC的广角X射线衍射显示特性X射线衍射图案中，样品中的这里考虑，大部分的散射强度是目前所有样本作为一个广义的各向同性的非晶态峰在大约0.5纳米的间隔，设有在左右0.85nm表示从水合020反思壳聚糖也观察到因为是1.2纳米从胶原螺旋 - 螺旋相互作用赤道间距以及0.286nm轴向周期性这是指示一个匝的胶原螺旋的。共混CC引起的信号的衰减直接指示胶原螺旋的性格，这是表明在图1其中衍射强度图100的胶原蛋白，90的胶原蛋白：10脱乙酰壳多糖和示的100的脱乙酰壳多糖样品。该图显示,纳米-1-强度图。胶原1.宽角X射线衍射的线性型材（暗蓝色），壳聚糖（绿色）和混合（80:20胶原蛋白：壳聚糖;粉红色）。该胶原蛋白分布是0.84和3.5nm的？1，显示清晰的峰这对应于胶原蛋白的螺旋 - 螺旋相互作用和之交分别是胶原蛋白的螺旋。壳聚糖显示在1.3nm高峰？1这是水合壳聚糖的特征。共混物只显示在2.1nm的峰值？1，它是一种无定形环中存在的所有样品。796 A. Sionkowska等。 /生物材料25（2004）795-801脱乙酰壳多糖的低含量可改变衍射从胶原蛋白的螺旋签名3.2。的广角数据PCA由于1.2和0.286nm峰出现积极的基础功能配置文件，显示这些功能的示例（即胶原特征）将具有正系数来基函数2.对应间距达到高峰0.85nm被示出为负，在基函数个人资料。此峰的存在的特征水合壳聚糖31。显示此特征样本将有负系数基函数2。 3示的系数为基函数2从CC的频谱融合，从纯胶原蛋白纯壳聚糖。该图表明，在100的胶原蛋白，和一个共混物的90:10的胶原蛋白：脱乙酰壳多糖，系数是阳性，表明天然胶原的存在。从混合20:80胶原：脱乙酰壳多糖至100脱乙酰壳多糖，系数出现负指示存在天然壳聚糖。的共混物从80:20至20:80的胶原蛋白：脱乙酰壳多糖显示没有相关的基础功能2，具有系数接近零值。这表明，有不远处就是胶原蛋白或壳聚糖在这些混合物没有衍射特性的主要因素是非晶环。检查的衍射这些样品的剖面证实，峰值在1.2，0.85和0.286毫微米不存在，表明有是这些样品中没有天然胶原或壳聚糖。图。2.基函数2从WAXSdata的PCA。正峰发生在0.84和3.5nm的1？;一个负峰出现在1.2纳米？1。该正峰可以归因于胶原特征的存在，在衍射轮廓。负峰值可以归属于脱乙酰壳多糖的样品中存在3.3。粘度法根据经典的哈金斯方程21，使用这里获得的数据，所述浓度依赖性比粘度，ZSP可制得。中的变化共混物的胶原含量特性粘度图。 4，其中共混物的粘度被看成是大于或者胶原或脱乙酰壳多糖单独。聚合物的混合物可能会表现出积极或从定义的理想行为负偏差由于存在或不存在的相互作用。聚合物 - 聚合物的混溶性可通过确定参数DB这说明粘度的偏差从预期由个别的比例组件表示。共混物的特性粘度比任一单独的聚合物的更高，和根据怦怦21的参数是分贝0;表明聚合物混溶性。图。3.系数基函数2.由于可以观察到，在高胶原蛋白含量的系数为正。在高壳聚糖水平系数是负的。在之间似乎存在一个高原区域中系数大致为零，这表明还有就是样品中没有天然胶原或壳聚糖存在图。特性粘度4.浓度依赖性。该限制粘数（GLL）是样品的粘度的量度。 如可以观察到，所述的共混物（）显示较高的粘度，要么胶原蛋白（E）或脱乙酰壳多糖（米）。这表明，第三成分存在于该可占由共混物各个组分之间的相互作用产生一个新的，粘性物质。3.4。傅里叶变换红外光谱傅立叶变换红外光谱（FTIR）脱乙酰壳多糖的光谱11示出了特征吸收带在3352，2932和2890厘米？1，这代表了-OH，-CH 2-CH 3和脂族基团，和带在15631414-11代表的NH-基团弯曲振动和的-OH基团的振动伯醇组，分别为。氨基具有在该区域的特征吸收带3400-3500厘米？1，其由宽吸收掩蔽频带从-OH基。在肩膀1635厘米？1代表C = O基团和建议脱乙酰壳多糖是部分脱乙酰化产物。胶原蛋白在1658，1554时至1240-11显示带，它们是酰胺I的特征，第二和第三频带胶原32,33。 I酰胺吸收产生主要来自蛋白质酰胺C = O伸缩振动，所述酰胺吸收由酰胺N-H弯曲振动和C-N伸缩振动（60和40的贡献的峰，分别）;酰胺三峰是复杂的，包括组件从C-N伸缩和N-H平面弯曲酰胺键，以及所引起的吸收从甘氨酸摇摆从CH2组振动骨干和脯氨酸侧链。主要酰胺III峰出现在1240厘米观察？1，有看到小峰在1204和1283厘米？1。相应的红外光谱CC显示在图。 5。在消委会的可混溶共混物的变化FTIR谱是由适当地进行比较来判断在理论融为一体，在规模增加的CC实验共混物和生产的差配置文件。这些例子可以看出，在图6。理论和实验之间最明显的偏差复合材料是在振动的模式分配到酰胺基团。对应于峰I酰胺峰显示变化的水平胶原被相对减少到脱乙酰壳多糖的在一个水平样品。胶原蛋白在样品降低的水平，I酰胺峰也减小，直到它存在仅作为小肩膀到酰胺峰。该酰胺峰仍然有不同CC的水平比较一致。峰的强度示出了一个普遍提高作为脱乙酰壳多糖的水平相对于样品增加胶原蛋白的水平。当没有胶原留在样品（如100的壳聚糖）的酰胺峰显示器转变1554年至1564年-1 1。相应的峰为酰胺III峰胶原显示的损失壳聚糖含量的增加强度，减少胶原蛋白的含量。在1283年厘米峰2 1持续到的CC的相对量是等价在样品。在1204时至1240厘米峰？1持续该样品直到样品材料的30是胶原。增加脱乙酰壳多糖的水平的样品中的超过70带来的这两个峰的损失。图。5.红外光谱胶原蛋白（红色）和脱乙酰壳多糖（黑色）。 有一个大量的两个样本之间的差异的峰而言强度和位置。特别是，胶原光谱显示一个大酰胺峰（1662厘米1？），更小的酰胺峰（1567厘米？1）和更大的酰胺三峰（1240厘米1）比壳聚糖光谱。壳聚糖的范围比显示更大的胶原蛋白的吸收2000-4000cm？1，具有特色的乐队，在3352，2932和2890厘米？1，并在1563强峰和1414厘米？1。图。CC混合（80的胶原蛋白的6红外光谱：20的壳聚糖;深蓝色）与理论谱（AQUA）和差曲线（粉红色）。 在这些光谱，很明显地看到，实验数据显示一更大的强度比理论数据，特别是在该区域1000-1700和2300-3700厘米？1。3.5。的FT-IR数据的PCAPCA是能够从100定义数据中的趋势胶原至100脱乙酰壳多糖。 图。图7示出的基础PCA的功能，开展了对红外光谱数据。 基础功能的一个示出了在1664正峰（用肩1637年），1283，1240和1204厘米-11，这是代表的酰胺和胶原III峰。基函数也示出了在小负峰1417和1583厘米？1。这些峰是由于峰的移位从1457年到1413厘米1和1554年至1654年-11从胶原壳聚糖，其更大的产生强度的这些区域。 图。图8示出的趋势在系数的变化，从胶原蛋白脱乙酰壳多糖通过共混物。当胶原存在作为主要所述共混物的组成，样品是正相关的基础功能1;当壳聚糖是混合样品是主要成分负相关的基础函数1。图。7，基函数1（深蓝色），2从PCA（粉红色）和3（绿）胶原/壳聚糖共混物的FT-IR光谱。最大程度的方差的样本中在1000-1700厘米的区域被观察到的1。在基础功能1正峰可以通过被占存在酰胺和峰。图八。系数共混物到基函数1.作为水平胶原减小，壳聚糖增加共混物的水平，有一个明显的趋势出现;系数从正变为负。这样做的原因可以从基函数1外推和数据，基础功能1显示了强烈的正峰酰胺和峰。作为胶原的水平的样品中的减小，所以做这些峰的强度。因此，系数降低也。3.6. PCA of FT-IR difference maps差分地图由减去实验获得的从理论轮廓的FT-IR型材。该地图的痕迹显示范围之间的变化的实际和理论数据。在所有情况下，一般的差异曲线的趋势是积极的，这表明真正的数据显示吸收比理论数据更高水平的;然而，差异是具体的，从混合有所不同混合。 PCA采用了更加详细审查变化在样品。PCA是能分辨的一些峰构成了很大的变化样本正在发生的样本。这一趋势的的基函数的系数是感兴趣。 基础功能1所示，除了一个样品无趋势（50:50胶原蛋白：壳聚糖）。基函数2显示了一般增加系数，从负到正，作为壳聚糖相对贡献胶原蛋白增加。基函数2是利益作为它的主要特点是在1552和1452厘米正峰？1。这些峰与酰胺峰一个的位置相一致肩峰观察实验，但不是对应于N-H弯曲理论数据。 本峰值仅出现在壳聚糖补多该共混物的50，为的是一个峰在1612年-11，这代表环外C = C键. 5.Discussion以前的研究通过Taraval和Domard 17,19和Domard和Taraval 18表明，CC互动是聚电解质，并且从数据的解释假定一个聚阴离子/聚阳离子的存在下复杂和竞争的胶原凝胶化过程。他们还提出了胶原的物理分离微凝胶包封由复杂，而且物含有变性胶原蛋白。他们的FTIR证据还指出了一个新颖的氢的存在结合在CC的互动，他们的结论是，在复合物的胶原变性。最近CC支架的研究11也表明的可行性使用CC可混溶共混物在瓣膜支架然而，这项研究利用戊二醛联共混物可能stabilse胶原螺旋与不能相比直接证据这里提出。该由作出的物理特征的结论Shanmugasundaram研究认为，CC的共混物既保留了母种的特性，然而络合物与戊二醛的交联，也就是说，带结果的直接比较这里介绍的不能进行。可能的是该戊二醛存在负责维持胶原螺旋结构和胶原 - 明胶 - 壳聚糖的三相位系统是最小化。这里提出的数据表明，CC共混物是混溶和改变的分子特性组件。尤其值得注意的是其中的偏差向着更加粘稠，粘测量溶液的共混物。这表明一个特定的相互作用之间的CC不能由一个简单的两相混合物来解释。我们的假设是，第三组件是负责一些增强的粘度具有最佳共混物在大约50的胶原蛋白和50的脱乙酰壳多糖（以重量计）。因为在这两个组件隔离具有较低的粘度，第三存在成分引起的壳聚糖在行动胶原可以解释这种行为。由于明胶具有比胶原一个较高的特性粘度，它指向胶原在复杂的更无序的形式.在胶原羟脯氨酸的-OH基团是参与链间氢键，而其他侧基之间的相互作用被认为是在形成原纤维的重要从多个单个分子。这些侧基能够形成氢键与-OH和NH 2基团在壳聚糖。此外，端基-COOH和-NH 2中的胶原蛋白也可能形成氢键的-OH和壳聚糖-NH2组，壳聚糖具有大-OH基团的数目。壳聚糖的长链能周围的胶原蛋白的三螺旋风;纠缠两种不同的大分子（CC）的可形成复杂的，它具有比单一高得多的粘度组件。此外，CC可以被离子键合。 这些分子能够形成配合的相反电荷的离子聚合物，特别是阳离子多糖chitisan和阴离子-COOH组中的胶原蛋白。这些相互作用可形成基本的基于CC的共混物的新材料的方法。广角X射线衍射数据也表明了在共混物中的胶原蛋白的螺旋性质的损失以及在是任何胶原胶原相互作用的丧失通常显眼的干燥阶段。从X射线衍射数据，这是有吸引力的推测混溶性诱导胶原螺旋的偏差结构，以更无序相类似，明胶。共混物中生产这样的第三阶段将是具有增加的粘度和螺旋的损失一致的衍射峰。明胶的X射线的存在衍射是有点“负面证明”，这是通常特点是没有的特性的螺旋特性和散射的相对增加5（A 34，X射线的PCA考试从纯胶原蛋白，壳聚糖和混合衍射显示元件2的小数贡献（图2）具有与共混组合物的关系（一正相关性作为胶原含量的函数），然