医院EGFR突变检测经验总结PPT课件.ppt

307医院EGFR突变检测经验总结 1 开展EGFR突变检测面临的问题 一 是什么和为什么二 怎么做及注意事项三 临床问题的解决 转化性研究 2 一 是什么和为什么 3 EGFR基因的基本情况 EGFR 表皮生长因子受体 4 EGFR的胞内信号传导途径 5 EGFR与肿瘤的生长及酪氨酸激酶抑制剂 TKI http www egfr 6 EGFR的突变与TKI类药物疗效 19外显子 5 TATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAG 3 21外显子 5 GGGCTGGCCAAACTG 3 NEnglJMed2004 350 2129 39 7 EGFR的突变类型 NatureReviewsCancer2007 7 169 181 8 肺癌靶向治疗的里程碑 IPASS研究 9 肺癌靶向治疗的里程碑 IPASS研究 NEnglJMed2009 361 947 57 10 肺癌靶向治疗的里程碑 IPASS研究 11 EGFR突变状态指导TKI类药物的使用 EGFR突变状态已成为患者能否在一线使用TKI药物的重要指标 12 二 怎么做及注意事项 13 目前较为常见的RGFR突变检测方法 http www egfr 14 EGFR突变检测中需要明确的几个基本概念 2 基因突变是指DNA发生碱基序列的改变 须选择有针对性的检测手段 针对非DNA的检测手段如 RT PCR 检测RNA表达 免疫组化 检测蛋白表达 以及针对非碱基序列的检测手段如 FISH 检测DNA的扩增 缺失 断裂 融合 等 均不适用 1 EGFR突变为体细胞突变 发生于肿瘤细胞中 正常细胞 癌旁或白细胞等 不含突变 要尽可能取到足量的肿瘤细胞进行检测 这是保证检测结果可靠的根本前提 15 EGFR突变检测中需要明确的几个基本概念 3 样品特性 异质性 突变细胞或DNA的含量一般较少 DNA经常会严重片段化4 关键是保证突变DNA有效扩增至可检测的范围 扩增效率及检测方法的敏感性 16 1 TapMan探针法 边扩增边检测 优势只检测突变的序列敏感性高且污染几率小不足探针费用较高只能针对已知突变正常DNA的扩增无限制 NatureReviewsDrugDiscovery2004 3 749 761 17 2 高分辨率溶解曲线 HRM 扩增后再检测 优势已知和未知突变序列敏感性高且污染几率小不足正常DNA的扩增无限制对仪器设备的要求较高阳性结果还需进一步确认 18 3 变性高效液相色谱分析 dHPLC 扩增后再检测 优势敏感性高已知和未知突变序列不足仪器普及率低正常DNA的扩增无限制开盖检测增加污染几率阳性结果还需进一步确认检测环境需独立且通风良好 19 4 直接测序法 扩增后再检测 优势直观且相对成本低已知和未知突变序列不足工作量大且敏感性低开盖会增加污染几率正常DNA的扩增无限制 Sanger测序法原理 20 5 焦磷酸测序 扩增后再检测 优势适合已知序列已知和未知突变均可测敏感性高 直观 能够定量不足需要专用仪器正常DNA的扩增无限制开盖会导致污染几率增加 21 6 突变富集PCR 扩增后再检测 抑制正常DNA扩增 优势敏感性高 此消彼长 不足操作繁琐只针对已知突变开盖导致污染几率增加不好找合适的限制性内切酶 ClinCancerRes2006 12 1 43 48 22 7 扩增阻滞突变系统 蝎形探针 边扩增边检测 优势敏感性高且污染几率小只扩增并检测突变的序列不足只针对已知突变试剂盒费用较高 72 延伸 94 解链 60 自身杂交发光 ARMS引物 23 各种突变检测方法的综合比较 http www egfr 1 操作流程2 污染几率3 敏感性4 可实施性 24 我们最初采用的方法 直接测序法 选择的理由结果直观易懂大量文献支持 金标准实验室条件能够满足要求 25 注意事项 DNA抽提部分 1 DNA提取之前的病理质量控制非常重要 它决定了最终检测结果的可靠性2 尽可能使用认可程度高的试剂 以保证DNA的提取效率 TaKaRaDEXPAT 3 严格按照说明书要求保存试剂 温度 湿度等 以免试剂失效4 可按自身需求对操作流程做适当修改 但要形成SOP操作规范 示例1 2 5 DNA提取区域与DNA扩增后的分析区域要完全分隔 以避免气溶胶污染 26 注意事项 PCR扩增部分 1 DNA质量控制非常重要 可保证后续实验的顺利进行 模板过量 PCR抑制剂 2 设置好阴性对照 避免污染 和阳性对照 验证实验体系 必要时可取消 3 选用保真性较高的Taq酶 避免由实验体系带来的假阳性4 做好详细的实验记录 为以后的各种分析提供依据 示例 Marker百倍稀释原液空白 Marker空白1921 Marker空白1921 27 注意事项 PCR扩增部分 28 注意事项 结果分析部分 报告力求简洁明了 不仅有检测结论还要有可靠的事实依据 29 注意事项 结果分析部分 检测结果随时归档 以备日后查询 统计 30 三 临床问题的解决 转化性研究 31 转化医学 转化医学 以患者为中心 建立临床治疗和基础研究间的双向通道 从临床工作中发现和提出问题 寻找或建立相应的解决方案 然后将其应用于临床 解决临床的实际问题 32 测序法敏感性不足将导致假阴性结果 FHirsch etal JCO2006CZhu etal JCO2008TMok etal DiscoveryMed2009 33 ADx ARMS 边扩增边检测且保证突变序列的有效扩增 ARMS引物 第一轮扩增64 退火保证特异性 第二轮扩增60 退火保证扩增效率扩增特异性由一轮引物保证 突变荧光信号 FAM内控荧光信号 HEX或VIC外控荧光信号 FAM阳性对照 内含阳性质粒阴性对照 蒸馏水内外控均检测EGFR基因2号外显子体系中含特殊石蜡避免气溶胶污染 34 ADx ARMS试剂盒的判读流程 是否污染 实验体系 DNA质量 DNA含量 结果判读 参数设置 35 ADx AMRS和DxsARM