免疫细胞的分离技术PPT课件.ppt

一 免疫细胞的种类与特征二 免疫细胞的分离技术三 免疫细胞分离的临床意义 第三节免疫细胞的分离技术 1 2 Innateimmunity固有免疫定义 人类在种系进化过程中形成的 经遗传获得的免疫 遇病原体后首先并迅速起防卫作用的免疫应答组成 皮肤 粘膜及其产物 细胞 NK细胞 单核 吞噬细胞 DC NKT 中性粒细胞 T细胞 B1细胞 等特点 先天具有 无潜伏期 无特异性 无记忆性作用时间 0 96小时 3 Adaptiveimmunity获得性 适应性 免疫定义 机体在生活过程中 因接触抗原性物质而获得的免疫 T B细胞识别病原体成分后产生的免疫应答特点 后天获得 有潜伏期 特异性 记忆性参与细胞 T细胞和B细胞起作用时间 晚 一般在感染后4 5天发挥作用 4 一 免疫细胞的种类与特征 5 免疫细胞的分类 根据免疫细胞在免疫应答中的作用可分为三类 免疫活性细胞 immunocompetentcells 抗原提呈细胞 antigen presentingcells APC 其他细胞 凡参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞 通称为免疫细胞 immunocyte 其中包括淋巴细胞 单核细胞 巨噬细胞 NK细胞 树突状细胞DC 肥大细胞 粒细胞等 6 7 免疫细胞的起源与分化 8 免疫活性细胞具有特异性抗原受体 在接受抗原刺激下发生克隆性活化 增值和分化 产生适应性免疫应答 adaptiveimmuneresponse 的细胞 这类细胞是机体产生特异性免疫应答的基础 包括T细胞 B细胞 9 抗原提呈细胞 antigenpresentingcell APC 加工处理抗原 将抗原肽提呈给抗原特异性淋巴细胞的一组免疫细胞 血液中主要的APC细胞主要包括单核细胞 树突状细胞 B细胞 10 其他细胞 自然杀伤 NK 细胞 肥大细胞 嗜酸性粒细胞 嗜中性粒细胞 嗜碱性粒细胞 血小板等 NK细胞 肥大细胞 嗜酸性粒细胞 嗜中性粒细胞 嗜碱性粒细胞 血小板 11 免疫细胞的特征 1 免疫细胞的形态学特征理化性状生物学特性 12 免疫细胞的特征 2 免疫细胞的表面分子特征 白细胞分化抗原指血细胞分化成熟为不同谱系 分化的不同阶段以及细胞活化过程中 出现或消失的细胞表面标记分子聚类分化群 分化抗原 clusterofdifferentiation CD 应用单克隆抗体鉴定为主的方法 将来自不同实验室的单克隆抗体所识别的同一分化抗原称为CD抗原 CD抗原常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志 13 14 人CD分组 分组CD 举例 黏附分子CD11a CD11c CD15 CD15s sLx CD18 整合蛋白 2 CD29 整合蛋白 1 CD49a CD49f CD54 ICAM 1 CD62E E整合蛋白 CD62L L整合蛋白 CD324 E cadherin CD325 N cadherin CD326 EpCAM 细胞因子 CD25 IL 2R CD95 Fas CD116 CDw137 CD178 FasL 趋化因子受体CD183 CXCR3 CD184 CXCR4 CD195 CCR5 CD261 CD264 TRAIL R1 TRAIL R4 内皮细胞CD105 TGF RIII CD106 VCAM 1 CD140 PDGFR CD144 VE钙黏蛋白 CD299 DCSIGN related CD309 VEGFR2 JAM1 CD321 JAM2 CD322 碳水化合物结构CD15u CD60a CD60c CD75 CDw327 CDw329 siglec6 7 9 树突状细胞CD85 ILT LIR CD273 B7DC CD274 CD276 B7H1 B7H3 CD302 DCL1 CD303 BDCA2 CD304 BDCA4 干细胞 祖细胞CD133 CD243基质细胞CD292 BMPR1A CD293 BMPR1B CD331 CD334 FGFR1 FGFR4 CD339 Jagged 1 红细胞CD233 CD242 15 二 免疫细胞的分离技术 一 外周血单个核细胞分离 二 T淋巴细胞及其亚群的分离 三 B淋巴细胞及其亚群的分离 四 Mo M 分离技术 五 NK细胞的分离技术 16 免疫细胞分离基本原理 不同细胞密度不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面分化抗原不同 17 根据不同的实验目的可以采取下列不同的分离方法 免疫细胞的分离技术 1 密度梯度离心法2 黏附分离法 尼龙毛法 贴壁法 亲和板法 3 磁性分离法4 荧光激活分离法5 其他分离法 花环沉降法 18 一 外周血单个核细胞分离 外周血单个核细胞 peripheralbloodmononuclearcells PBMC 包括淋巴细胞和单核细胞Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细胞 是根据不同细胞密度不同的分离法 19 不同细胞密度不同 单个核细胞 淋巴细胞和单核细胞 的密度为1 077左右人的红细胞密度为1 093 1 077粒细胞密度为1 092 1 077血小板密度 1 077 20 肝素抗凝静脉血与等量Hank s液或PBS混匀沿管壁缓慢叠加于Ficoll分层液面上水平离心2000rpm 20min离心后管内分三层 用毛细血管插到云雾层 吸取单个核细胞洗涤细胞两次RPMI1640重悬细胞台盼兰染液混合计数细胞活力检测 死的细胞可被染成兰色 活细胞不着色活细胞数活细胞百分率 100 总细胞数 方法 用本法分离PBMC 一般纯度在90 以上 收获率可达80 90 活细胞百分率在95 以上 21 二 T淋巴细胞及其亚群的分离 22 T淋巴细胞亚群 T细胞的发育阶段分类表达TCR的类型分类是否表达CD4或CD8T细胞功能分类 23 T淋巴细胞亚群 T细胞的发育阶段分类初始T细胞naiveTcells未经抗原刺激的成熟T细胞 表达CD45RA效应T细胞effectorTcells表达高亲和力IL 2R 介导免疫效应记忆T细胞memoryTcells表达CD45RO 介导再次免疫应答 24 T淋巴细胞亚群 表达TCR的类型分类TCR T细胞TCR T细胞 25 T淋巴细胞亚群 是否表达CD4或CD8CD4 T细胞CD8 T细胞 26 T淋巴细胞亚群 T细胞功能分类辅助性T细胞HelperTcells Th效应T细胞EffectorTcells TE细胞毒T细胞CytotoxicTlymphocytes CTL迟发性变态反应T细胞DelayedTcells Td初始T细胞NaiveTcells调节性T细胞RegulatoryTcells Tr记忆T细胞MemoryTcells Tm抑制性T细胞SuppressorTcells Ts 27 辅助性T细胞HelperTcells Th Th1 细胞免疫Th2 体液免疫Th17 炎症反应 28 辅助性T细胞HelperTcells Th TGF IL 6 29 辅助性T细胞HelperTcells Th 滤泡辅助性T细胞 Tfollicularhelper Tfh 通过细胞因子IL 10和IL 21来调节B细胞的功能 30 CD4 CD25 Foxp3 Treg细胞的分化Foxp T调节细胞可以从胸腺直接分化 也可在TGF 作用下从Foxp3 T细胞分化 调节性T细胞RegulatoryTcells Tr 31 玫瑰花结法 E花环沉降法 尼龙毛柱分离法淘洗法免疫磁珠法流式细胞术分选法 二 T淋巴细胞及其亚群的分离 32 人T淋巴细胞表面表达CD2分子 即绵羊红细胞受体 B细胞则无 在适当的条件下 可与绵羊红细胞 SRBC 结合 形成玫瑰花结 rosette 因为红细胞环绕T细胞 形似花环 所以又称E 花环 E rosette 该实验常用于临床检测人外周血T淋巴细胞的数量和比例 由此可间接反映机体的细胞免疫功能状况 玫瑰花结法 33 淋巴细胞 SRBC悬液 37 C水浴10min 低温低速离心 T细胞形成E花环而沉于管底 悬液中为B细胞 方法 34 混合单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱时 B细胞 浆细胞 单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼龙毛上 而T细胞不与尼龙毛粘附的特性 这是获得富含T细胞群的有效方法 尼龙毛柱分离法 35 简单 快速 经济 尼龙毛可反复利用可分离大量细胞细胞不会被激活 可用于功能测定 纯度不高耗时 优点 缺点 36 也叫亲合板结合分离法 immunepanningisolation 利用亲合层析和抗体固相包被原理 将相应抗体结合于塑料平板上 由于各种淋巴细胞亚群具有不同抗原性的特点和表面标志 加细胞悬液后 凡抗原阳性的细胞则与相应的固相抗体结合 抗原阴性的细胞可从未吸附的细胞悬液中获取同理若用特异性抗原交联于塑料板上 则可分离得到具有特异抗原受体的淋巴细胞 但淋巴细胞受体与特异抗原或抗体连接后有可能引起细胞激活 因此 凡欲去除细胞悬液内某一细胞亚群时 本法更合适 淘洗法 37 亲和板分离淋巴细胞示意图 38 利用T淋巴细胞表面某种标志性抗原与包被在固相载体上的特异性单抗结合 将T细胞与其他细胞分离的方法 T淋巴细胞淘洗分离原理 39 羊抗兔Ig包被平皿CD4一抗培育T细胞 倒入平皿 4 孵育1小时 收集未粘附的CD4 T细胞PBS漂洗非特异吸附的CD4 T细胞收集粘附的CD4 T细胞 可以用刮板刮取并在显微镜下观察 方法 以CD4 T细胞为例 40 免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合 在外加磁场中 通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中 无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性 不在磁场中停留 从而使细胞得以分离 免疫磁珠法 Magneticactivatedcellsorting MACS 41 42 N S 阳性选择法 正选 43 N S 阴性选择法 负选 44 45 免疫磁珠细胞分选装置 46 47 将特异性抗T细胞表面分子的单克隆抗体与磁性小珠形成免疫磁珠 用这种免疫磁珠从PBMC中结合T细胞在磁场中 结合T细胞的免疫磁珠固定了 未结合的其它细胞被洗脱下来撤离磁场 再从免疫磁珠上洗脱T细胞 免疫磁珠法阳性选择T细胞 48 将多种特异性抗非T细胞表面分子的单克隆抗体与磁性小珠形成免疫磁珠 用这种免疫磁珠从PBMC中结合非T细胞在磁场中 结合其它细胞的免疫磁珠固定了 未结合的T细胞被洗脱下来 免疫磁珠法阴性选择T细胞 49 CD4 TCellIsolationKitII Non CD4 TcellsinPBMC i e CD8 Tcells Tcells Bcells NKcells dendriticcells monocytes granulocytes anderythroidcells areindirectlymagneticallylabeledbyusingacocktailofbiotin conjugatedantibodiesagainstCD8 TCR CD19 CD56 CD14 CD16 CD36 CD123 andCD235a glycophorinA ThesecellsaresubsequentlymagneticallylabeledwithAnti BiotinMicroBeadsfordepletion Thereby highlypureCD4 Tcellsareobtained 免疫磁珠法阴性选择CD4 T细胞实例 PBMCbeforeseparation UntouchedCD4 Tcells 50 荧光激活细胞分离法 fluorescenceactivatedcellsorter FACS 51 FACS 用途 用流式细胞仪对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术原理 包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴 形成包含单个细胞的液滴 在激光束的照射下 这些细胞发出散射光和荧光 经探测器检测 转换为电信号 送入计算机处理 输出统计结果 并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群 分离纯度可达99 52 53 方法 以CD4 T细胞为例 PBMC用PBS洗涤 低温离心弃上清 加入含AB血清的PBS封闭 4 孵育10分钟 加入适量的PerCP CD3 APC CD4抗体 4 孵育30分钟 PBS洗涤 低温离心弃上清并用RPMI1640重悬 流式细胞术分选 54 三 B淋巴细胞及其亚群的分离 如果仅考虑PBMC中T细胞和B细胞 那么所有从PBMC中分离T淋巴细胞的方法实际上也可用于分离B淋巴细胞 55 B细胞表面标志 SmIg Fc受体 补体受体 EB病毒受体 部分CD分子是B细胞的重要表面标志 其中以SmIg为B细胞所特有 是鉴定B细胞可靠的指标CD19 CD5分子 可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞 B1细胞为CD19和CD5双阳性 而B2细胞仅为CD19阳性 B2细胞为通常所指的B细胞 56 终浓度5mML leucinemethylester L LME 重悬PMBC 混匀 室温35s离心 400g 10min 弃上清 PBS洗涤细胞重悬于25mlRPMI1640培养基 过尼龙毛柱 去除细胞团块玫瑰花结法去除T细胞抗CD19或CD20单抗标记 流式细胞仪检验B细胞纯度 去除Mo M 法 57 将特异性抗B细胞表面分子CD19的单克隆抗体免疫磁珠与PBMC混合 用这种免疫磁珠从PBMC中结合B细胞在磁场中 结合B细胞的免疫磁珠固定了 未结合的其它细胞被洗脱下来撤离磁场 再从免疫磁珠上洗脱CD19 B细胞 免疫磁珠法阳性选择B细胞 58 将多种特异性抗非B细胞表面分子的单克隆抗体与磁性小珠形成免疫磁珠 用这种免疫磁珠从PBMC中结合非B细胞在磁场中 结合其它细胞的免疫磁珠固定了 未结合的B细胞被洗脱下来 免疫磁珠法阴性选择B细胞 59 BCellIsolationKitII Non Bcells i e Tcells NKcells monocytes dendriticcells granulocytes platelets anderythroidcells areindirectlymagneticallylabeledusingacocktailofbiotinylatedCD2 CD16 CD14 CD36 CD43 andCD235a glycophorinA antibodies ThesecellsaresubsequentlymagneticallylabeledwithAnti BiotinMicroBeadsfordepletion HighlypureBcellsareobtainedbydepletionofmagneticallylabelednon Bcells PBMCbeforeseparation UntouchedBcells 免疫磁珠法阴性选择B细胞实例 60 四 Mo M 分离技术 单核 巨噬细胞包括骨髓中的前单核细胞 外周血中的单核细胞 以及组织内的巨噬细胞 M M 来源于血液中的单核细胞 而单核细胞又来源于骨髓中的前体细胞 61 Mo M 细胞表面标志 表面标志抗原 CD14 但CD14也表达在粒细胞 CD14主要强表达在单核 巨噬细胞 弱表达在粒细胞上 62 无血清RPMI1640培养液将PBMC2 106cell ml重悬 75ml培养瓶中加入10ml细胞悬液 于培养箱内37 孵育1小时 吸尽培养液 RPMI1640培养液漂洗2遍 去除非黏附细胞 细胞刮片轻轻刮取黏附的单核细胞 黏附法 63 快速 方便纯度和得率均较低易引起Mo M 激活 引起基因表达和分泌蛋白 优点 缺点 64 将特异性抗单核细胞表面分子CD14的单克隆抗体免疫磁珠与PBMC混合 用这种免疫磁珠从PBMC中结合单核细胞在磁场中 结合单核细胞的免疫磁珠固定了 未结合的其它细胞被洗脱下来撤离磁场 再从免疫磁珠上洗脱CD14 单核细胞 免疫磁珠法阳性选择单核细胞 65 将多种特异性抗非单核细胞表面分子的单克隆抗体与磁性小珠形成免疫磁珠 用这种免疫磁珠从PBMC中结合非单核细胞在磁场中 结合其它细胞的免疫磁珠固定了 未结合的单核细胞被洗脱下来 免疫磁珠法阴性选择单核细胞 66 MonocyteIsolationKitII Non monocytes suchasTcells NKcells Bcells dendriticcells andbasophils areindirectlymagneticallylabeledusingacocktailofbiotin conjugatedantibodiesagainstCD3 CD7 CD56 CD19 CD16 CD123 andCD235a GlycophorinA aswellasAnti BiotinMicroBeads Highlypureunlabeledmonocytesareobtainedbydepletionofthemagneticallylabeledcells PBMCbeforeseparation UntouchedMonocytes 免疫磁珠法阴性选择单核细胞 67 PBMC用PBS洗涤 低温离心弃上清加入含AB血清的PBS封闭 4 孵育10分钟加入适量的FITC CD14抗体 4 孵育30分钟PBS洗涤 低温离