肿瘤细胞与分化、凋亡(一)PPT课件.ppt

肿瘤细胞与分化 凋亡 一 源于一位权威专家的课件 和大家一起分享 1 前言 大量研究证明 肿瘤的发生是多因素 多阶段 多基因共同作用的结果 其特点是多因素 环境因素 如物理 化学 生物等 机体因素 如遗传 免疫 年龄与性别等 交互作用 有的起致癌作用 即诱导细胞恶性转化 有的起促癌作用 肿瘤的发生发展经历了启动 促发 侵袭 转移等阶段 并且 各阶段都可能发生多种癌基因激活 抑癌基因失活 表现为增生过度 分化异常 凋亡受阻 2 长期以来 细胞一旦癌变后 就永远是癌细胞 的观点一直统治着肿瘤学领域 即恶性肿瘤是不能逆转的 在这种思想指导下 传统的肿瘤治疗不外乎外科手术切除 化疗 放射或免疫治疗 1971年 Friend报告小鼠红白血病细胞 MEL 可被二甲基亚砜 DMSO 诱导分化 开创了肿瘤细胞分化研究的先河 目前 诱导肿瘤细胞分化的已经成为重要研究前沿 细胞分化与肿瘤 3 一 肿瘤细胞诱导分化的有关概念 1 分化 differentiation 细胞分化是指幼稚的胚胎细胞生长发育为各种不同形态结构和功能代谢的成熟细胞的过程 如人起源于一个受精卵 通过细胞分裂形成内 中 外三个胚层细胞 4 2 反分化 retro differentiation 又称去分化 dedifferentiation 肿瘤的反分化是指细胞恶变后 细胞的多种表型又回到胚胎细胞表型的现象 恶性肿瘤细胞表现分化异常 不成熟 5 3 再分化 redifferentiation 又称逆转 reversion 它是指在分化诱导剂的作用下 恶性肿瘤细胞被诱导而重新向正常细胞的方向演变分化 表现为形态学 生物学 生物化学等诸多指标均向正常细胞接近 甚至完全转变为正常细胞 6 二 分化诱导剂 1 内源性分化诱导剂内源性分化诱导剂是由肿瘤或宿主细胞产生的具有分化诱导作用的化学物质 它有以下几种 集落刺激因子 CSF 分为CSF M和CSF G 粒细胞巨噬细胞分化因子 GM DF 类固醇类化合物 如糖皮质激素和1 25 OH 2 vitD3 细胞因子 如TNF 和INF 糖脂 如神经节苷脂GM3 其它 如cAMP等 7 2 外源性分化诱导剂可分为以下几类 无机化合物 亚硒酸钠等 简单的有机化合物 正丁酸 二甲基亚砜 DMSO 六次甲基二乙酰胺 HMBA 等 维生素A类化合物 维甲酸 AM80 芳维甲等 佛波酯类化合物 12 O 十四酯酰佛波 13 乙酸 TPA 抗生素类 放线菌素D 丝裂霉素等 抗癌药 6 巯基嘌呤 5 氮胞嘧啶等 8 三 诱导肿瘤分化的研究 1 体外分化诱导模型 1 白血病细胞分化诱导模型最常用的是急性髓性白血病细胞株HL 60 它在分化诱导剂作用下可出现分化表型如形态上由早幼粒白血病细胞分化为中 晚幼粒 杆状核细胞和分叶核细胞 生化方面出现硝基蓝四氮唑还原性 NBT 功能方面出现吞噬活性及趋化性 生物学方面丧失了在软琼脂培养基上形成集落及裸鼠体内移植成活的能力 9 2 实体瘤分化诱导模型人胃癌分化诱导模型国内外有人用DMSO HMBA suramin 维甲酸 大蒜油及大蒜与其烯丙基硫化合物等处理胃癌细胞株时 癌细胞在形态结构 功能代谢和生物学等方面均出现分化特征 人神经母细胞瘤分化诱导实验在正丁酸 苯丁酸及其盐类作用后 瘤细胞可形成树突状结构 功能上能产生神经递质合成酶 生物学上其致瘤性明显降低 表现出分化的特点 10 人粘液表皮样癌分化诱导实验MEC 1细胞是上皮样细胞 体外增殖迅速 形态异型性明显 裸鼠体内成瘤性 在HMBA的作用下出现分化表型 生长抑制 核异型性降低 表面微绒毛减少 胞浆内粗面内质网增加和出现特征性的成熟分泌颗粒 DNA含量减少及倍体趋向二倍体等 其它实体瘤分化诱导模型其它实体瘤如黑色素瘤 肝癌 前列腺癌 胶质母细胞瘤 肺癌等均有报道 11 2 体内分化诱导模型目前 体内分化诱导尚无理想的模型 人白血病细胞一般采用小鼠腹腔扩散法及裸鼠皮下移植法 人实体瘤采用小鼠肾包膜下移植和裸鼠移植建立分化诱导模型 分化诱导效果主要根据肿瘤生长抑制和荷瘤鼠生命延长 细胞标记酶 抗原以及形态的变化来判断 国内用NB4细胞株建立了SCID小鼠人APL腹水细胞模型 在ATRA作用下能发生分化 如明显提高NBT还原率和CD11b的表达 小鼠的生存期明显延长 该模型的建立是评价新的或已有的治疗APL药物和临床前期实验研究的理想模型 12 3 分化诱导的临床试验尽管诱导分化研究取得了成绩 但其最终目的是能应用于临床 ATRA治疗APML能有效地达到临床缓解 被认为是人类恶性肿瘤分化治疗的成功典范 ATRA能诱导APL病人恶性肿瘤细胞分化成熟 口服ATRA可使大多数患者达到完全临床缓解 即使是传统化疗失败后亦是如此 在欧洲的随机实验证实 ATRA加化疗比单用化疗方案能明显降低复发率和延长生存期 13 四 诱导肿瘤细胞分化的调控机制1 核内受体途径维甲类化合物诱导肿瘤细胞分化主要通过核内受体途径 维甲酸受体 RAR 是广泛存在各种组织细胞核内的一类受体蛋白 有RARS和RXRS两类 每一类又有 三种类型 比较其DNA序列和结构特点 二者属于类固醇 甲状腺素 vitD3受体在内的核内受体超家族 在细胞液内存在RA结合蛋白 能将RA从细胞浆运输到核内染色体上的受体部位 自身则释放回到胞浆 RA经胞质内RA结合蛋白运输到染色体上的受体部位 与核受体以二聚体形式结合某些靶序列 进而引起特定基因的转录激活或转录抑制来诱导细胞分化 14 Manfredini等用ATRA和vitD3诱导白血病母细胞分化实验中发现 M0 M1对二者不敏感 M3在ATRA诱导下向粒细胞方向分化 M2则在二者诱导下向单核细胞分化 进一步研究方发现 ATRA和vitD3有效地增加核内VDR VDR与RXR形成二聚体 再结合到DR3型VD反应元件 从而激活VD反应元件调控的报告基因的转录 启动了M2向单核细胞方向分化 15 2 影响基因转录Naka等用9 cis 维甲酸诱导胃癌细胞株分化研究中 发现大多数胃癌细胞株能合成RARs和RXRsmRNA 其中一些细胞株并不停滞于G0 G1期 但可一过性增加p21WAF1蛋白表达 降低CDK7 EGFR及cyclinD蛋白量 减少Rb基因产物磷酸化 认为9 cis 维甲酸抑制细胞生长是通过调控细胞周期 影响维甲酸受体mRNA转录来实现的 16 Okabe发现TPA可诱导Ph 阳性白血病细胞MC3向巨核细胞系分化 血小板糖蛋白GP b表达增强 GP bmRNA水平增高 处理组有GATA 1表达 而GATA 3不表达 未处理组仅GATA 2转录 TPA则通过影响GP b及GATAs转录来诱导MC3细胞分化 Garingo在诱导MEL分化中发现红细胞特异性基因转录活化 PKA缺陷时则转录出现障碍 转录因子NF E2是提高球蛋白位点控制区活性的必须成分 DNA与NF E2结合 球蛋白位点控制区增强子活性在PKA缺陷细胞中明显低于具有PKA活性的细胞 PKA对转录因子的调控影响了红细胞特异基因转录而诱导MEL细胞分化 17 研究表明 染色质重塑在基因转录调控中有重要作用 而组蛋白乙酰化 去乙酰化修饰是影响染色质重塑的重要因素 我们前期研究的基础上 建立人胃癌MGC803细胞裸鼠移植瘤模型 以被证实有显著诱导肿瘤细胞分化的药物丁酸钠 Sodiumbutyrate SB 为阳性对照 观察DADS diallyldisulfide 在体内外诱导MGC803细胞分化时 对其核组蛋白乙酰化表达的调控作用 以及二者之间的关系 进一步探讨DADS对MGC803细胞抑制和诱导分化的作用机理 18 H3 actin DADS mg L 1 153060 30SB mM 55 DADS对体外培养MGC803细胞组蛋白乙酰化的影响 19 H4 actin DADS mg L 1 153060 30SB mM 55 DADS对体外培养MGC803细胞组蛋白乙酰化的影响 20 p21WAF1 actin 处理时间 h 12h24h12h24h12h24h12h24hDADS mg L 1 00151530306060 DADS对MGC803细胞p21WAF1蛋白表达的影响 21 DADS对各组移植瘤组织中乙酰化组蛋白表达的影响 H3 actin 各处理因素 NSSBDADSDADSDADS浓度 mg kg 1 6650100200 22 H4 actin 各处理因素 NSSBDADSDADSDADS浓度 mg kg 1 6650100200 23 DADS对移植瘤细胞p21WAF1表达的影响 p21WAF1 actin 各处理因素 NSSBDADSDADSDADS浓度 mg kg 1 6650100200 24 3 对癌基因和抑癌基因的影响细胞的基因控制细胞的生长与分化 而这些基因的变化则影响基因的表达或功能被认为是癌变的主要原因 Ras基因在细胞内有H K N Ras 编码分子量为21kd的蛋白 p21Ras蛋白具有GTP酶活性 Ras能使3T3细胞恶性转化 促使细胞增殖 C myc过表达可以促进基因转录和细胞分裂 与肿瘤的形成关系密切 P53基因编码P53蛋白 P53蛋白有野生型和突变型 野生型P53基因具有抑制细胞增殖和转化的作用 25 李晓光等用大蒜油诱导MGC803细胞分化和凋亡研究中 发现处理组细胞形态接近正常细胞 细胞的致瘤性明显下降 Northern杂交有P53和P21表达增强 提示大蒜油通过促进抑癌基因P53 P21的表达 抑制细胞恶性增殖 诱导凋亡和促进细胞分化 王代树等用HMBA诱导MGC803细胞分化时发现C myc和C H ras表达抑制 Naka用9 顺 维甲酸诱导胃癌细胞分化时则有P21蛋白一过性增加 这些基因在诱导癌细胞分化过程中的改变进一步影响其调控的基因表达而实现瘤细胞分化的效应 26 我们发现 DADS作用下 MGC803细胞明显抑制 且呈剂量 效应依赖关系 瘤细胞对ConA的凝集率 集落形成率与ALP比活性下降 瘤细胞异形性降低 核浆比下降 细胞表面微绒毛数目减少 胞浆内细胞器丰富 胞核及部分细胞器呈退行性变 可见细胞间连接结构 细胞骨架蛋白合成增加与重组 细胞间缝隙连接通讯功能恢复 提示DADS可诱导MGC803细胞分化 DADS处理后的MGC803细胞S期细胞含量减少 G2期细胞含量增加 细胞停滞于G2期 p21WAF1 Rb表达增强 p21ras c Myc 突变型p53表达减弱 27 MTT比色实验结果 28 DADS对MGC803细胞生长的影响 29 倒置显微镜观察 MGC803细胞 20 DADS组 20 30 普通光镜观察 MGC803细胞HE 20 DADS处理组HE 20 31 电镜观察微绒毛是良恶性细胞区分的重要标志之一 本实验通过透射电镜和ConA凝集性实验证实了MGC803细胞在DADS处理后 细胞表面微绒毛明显减少 对ConA的凝集率下降 表明MGC803细胞生物学行为表现出恶性性下降 未处理组MGC803细胞核浆比例大 核仁均质 以1 2个核仁细胞为主 胞质内细胞器稀少 细胞分化程度低 DADS处理的MGC803细胞表面微绒毛减少 细胞核浆比例下降 胞质内细胞器丰富 有散在的核糖体 细胞核和线粒体水肿退变 细胞之间有腺腔结构形成并可见细胞间连接结构 细胞分化好 32 33 MGC803细胞核浆比例大 核畸形 线粒体水肿 5000倍 34 图示DADS组细胞电镜结构 35 图示DADS组细胞电镜结构 36 结构的破坏及功能的抑制都是细胞转化早期的异常表现 并与细胞增殖失控及其它恶性行为有关 而微管解聚与DNA合成的启动有关 本实验中观察到DADS处理后 MGC803细胞出现微丝微管合成增加与重组装 呈现规则的放射状分布 提示瘤细胞恶性表型下降 表现为去恶化 37 MGC803细胞骨架考马丝亮蓝染色 20 DADS组细胞骨架考马丝亮蓝染色 20 38 细胞结构观察 MGC803细胞骨架呈弥散荧光间接免疫荧光染色 100 DADS组细胞骨架阳性 呈黄绿色荧光环绕胞核 间接免疫荧光染色 100 39 划痕标记后数分钟即可观察到黄色荧光传播 人胃癌MGC 803细胞不显示荧光染料的传播 表明无间缝隙连接通讯功能 DADS处理后 黄色荧光分布在伤沿细胞列和相邻的数列细胞内 荧光强度从伤沿细胞列到临近数列细胞逐渐减弱 以伤沿细胞列最强 表明间缝隙连接通讯功能恢复 40 细胞间缝隙连接通讯功能 未处理人胃癌细胞LuciferYellow 10 处理组人胃癌细胞LuciferYellow 10 41 MGC803细胞 p53表达 DADS组 42 p21WAF1表达 DADS组 MGC803细胞 43 MGC803细胞 DADS组 pRb表达 44 MGC803细胞 DADS组 p21ras表达 45 MGC803细胞 DADS组 C Myc表达 46 裸鼠移植瘤形成实验 47 移植瘤形成实验 48 表1 DADS处理后各组裸鼠移植瘤重量变化情况 49 移植瘤光学显微镜下形态变化HE 40 A 未处理组 B 100mg kg 1DADS处理组 50 PCNA actin 各处理因素 NSSBDADSDADSDADS浓度 mg kg 1 6650100200 DADS处理移植瘤后PCNA蛋白表达 51 SSH技术成功构建DADS诱导人胃癌细胞MGC803细胞差异表达基因的cDNA文库 差异表达片段DADS1 长208bp 为人类 synuclein基因部分序列 其上调可能与DADS诱导人胃癌MGC803细胞分化相关 差异表达片段DADS2 长272bp 与鱼类hepcidin likeprecursormRNA具有高同源性 其上调可能与DADS造成细胞内低铁低氧环境 继而诱导人胃癌MGC803细胞分化相关 52 不同浓度的DADS可显著抑制HL 60细胞的增殖 且与药物浓度有明显依赖关系 0 625 2 5 g mL时 NBT还原反应显著增强 且在1 25 g mL 1时诱导分化作用达峰值 DADS小鼠肾囊膜下移植的HL 60细胞具有显著的生长抑制作用 并呈剂量依赖关系 21mg kg时抑瘤率达49 5 21 42mg kgDADS可诱导HL 60细胞向中性粒系方向分化 DADS对HL 60细胞作用的研究 53 DADS对HL 60细胞呈浓度依赖性的生长抑制效应 54 1 25 g mL 1DADS处理HL 60细胞不同时期NBT还原反应的变化 55 未处理的HL 60细胞处理的HL 60细胞 56 DADS对小鼠肾囊膜下HL 60细胞的诱导分化作用 57 4 影响细胞周期蛋白活性研究者们认为 细胞周期的失调控是癌症发生发展的原因 而细胞周期素cyclins 细胞周期素依赖性激酶CDKs及调节CDKs的激酶和磷酸酶则是细胞周期调控的分子基础 在真核生物细胞进行有丝分裂时 其细胞周期可分为间期 G1期 S期 G2期 和M期 G1期细胞可进入持续时间不等的G0期 58 我们上述研究结果显示 pRb p21表达的增强和c Myc Ras及突变型p53表达减弱均可导致细胞停滞于G1期 本实验采用流式细胞仪检测了MGC803细胞在DADS作用后细胞周期的分布 结果表明细胞停滞于G2期而非G1期 DADS可诱导HL 60细胞表面分化抗原CD11b表达升高 CD33表达下降及细胞周期阻滞在G0 G1期 59 DADS对人胃癌MGC803细胞周期的影响 60 0 g mL 1DADS0 625 g mL 1DADS1 25 g mL 1DADS 2 5 g mL 1DADS5 g mL 1DADSATRA DADS对白血病HL 60细胞周期的影响 61 DADS对HL 60细胞周期的DNA含量的影响 62 CD11bCD33 DADS对HL 60细胞表面分化抗原的影响 63 流式细胞术检测结果显示经SB和100mg kg 200mg kgDADS作用后 MGC803细胞移植瘤细胞G2 M期百分率分别比NS对照组增加1 92 2 22和3 37倍 P 0 05 表明DADS呈浓度依赖性对移植瘤细胞有G2 M期阻滞 64 不同浓度DADS处理后移植瘤细胞周期的变化 NS组SB组DADS50mg kg 1组 DADS100mg kg 1组DADS200mg kg 1组 65 研究表明 cyclin有7种 它们的表达随细胞周期时相的转换而发生改变 不同cyclin须与相应的CDK结合才能促使细胞周期的完成 细胞增殖分裂过程中 cyclins有如下变化 细胞由G0期进入G1期时 cyclinD1 3合成均增加 G1 S期时 cyclinDs及cyclinE降解 cyclinA合成增加 S期进入G2期时 cyclinB合成逐渐增加积累 G2 M期转换时 cyclinA B降解 cyclinDs E合成增加 cyclinD1在细胞增殖过程中意义最大 是G1期细胞增殖信号的关键蛋白 许多作者将它视为一种癌基因 其过度表达可导致细胞增殖失控 最终形成肿瘤 66 CDKs由CDK1 7组成 其在细胞周期的特定时间与相应的cyclin结合后 并经磷酸化或去磷酸化后方具有生物活性 促使与细胞周期有关蛋白的基因表达 从而对DNA合成及有丝分裂进行调控 G1 S期有不同的cyclin CDK复合体 cyclinD CDK4和cyclinE CDK2激酶活性是细胞周期G1 S期转换所必须的 与cyclinA E结合的CDK2激酶活性在G1 S期转换时升高 而在M期则降低 67 CyclinB cdc2复合体的活性是细胞进入M期所必的 而G1 S期转换 关系到细胞周期的启动 G2 M期转换则是细胞进行有丝分裂增殖的前提 CDIs是CDKs的负调控因子 可使CDKs失活 cyclins是CDKs的正调控因子 使CDKs活化 二者对CDK活性的影响控制细胞周期各时相的转换 CDIs可分为两类 一类是P16家族 包括P16 P18 P15 P19 特异地抑制CDK4和CDK6 另一类是P21家族 它包括P21 P27 P57 对CDK具有广谱的抑制作用 68 Lee用flavopiridol处理NSCLC细胞株NCI H358时 发现flavopiridol可使该细胞生长停止和诱导分化 且分化的启动与cdk2失活相一致 westernblot分析处理后细胞的有cyclinE和D1的缺失 表明CDKs调控亚单位缺失是CDK2激酶失活的一个原因 同样CDK1 2 5的抑制剂roscovitine也可以诱导NCI H358细胞分化 因此诱导分化剂可能通过阻抑CDK2的活性诱导细胞分化 69 我们应用Westernblot分析发现 在G2 M期阻滞同时有Cdc25C蛋白表达下降 但CDK1蛋白表达不受DADS作用的影响 表明DADS对MGC803细胞的抑制增殖作用与G2 M期阻滞有关 其分子机理可能与降低Cdc25C蛋白水平有关 p38通路调节Cdc25C磷酸酶的表达在DADS诱导MGC803细胞G2 M期阻滞中起着重要作用 70 DADS对人胃癌MGC803和BGC823细胞G2 M期检查点激酶通路的影响 RT PCR检测Chk1和Chk2在mRNA水平的改变Westernblot检测各蛋白的改变免疫共沉淀检测Chk1 Chk2与Cdc25C结合 71 M123456 600bp300bp Chk1 actin RT PCR检测MGC803 BGC823细胞Chk1mRNA表达水平M Marker 1 MGC803细胞对照组 2 3 DADS处理MGC803细胞1d 2d 4 BGC823细胞对照组 5 6 DADS处理BGC823细胞1d 2d 72 M123456 600bp300bp Chk2 actin RT PCR检测MGC803 BGC823细胞Chk2mRNA表达水平M Marker 1 MGC803细胞对照组 2 3 DADS处理MGC803细胞1d 2d 4 BGC823细胞 5 6 DADS处理BGC823细胞1d 2d 73 DADS诱导MGC803和BGC823细胞Chk1和P Chk1表达 0124812 hr P Chk1 Ser345 Chk1 actin DADS对MGC803细胞磷酸化Chk1表达的影响 74 P Chk1 Ser345 Chk1 actin DADS对BGC823细胞磷酸化Chk1表达的影响 0124812 hr 75 DADS诱导MGC803和BGC823细胞Chk2和P Chk2表达 0124812 hr P Chk2 Chk2 actin DADS对MGC803细胞磷酸化Chk2表达的影响 76 0124812 hr P Chk2 Chk2 actin DADS对BGC823细胞磷酸化Chk2表达的影响 77 DADS诱导MGC803和BGC823细胞ATR和P ATR的表达 015306090120 min P ATR Ser428 ATR actin DADS对MGC803细胞磷酸化ATR表达的影响 78 015306090120 min P ATR Ser428 ATR actin 图27DADS对BGC823细胞磷酸化ATR表达的影响 79 DADS诱导BGC823细胞Chk下游分子CDC25C CyclinB1的表达 012243648 hr CDC25C actin DADS对BGC823