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蛋白质化学 蛋白质的概念蛋白质 Protein 是由许多不同的氨基酸 按照一定的顺序 通过肽键连接而成的一条或多条肽链构成的生物大分子 1 二 蛋白质的生物学意义 蛋白质是构成生物体最基本的结构物质和功能物质 蛋白质是生命活动的物质基础 是生命活动的主要体现者 结构骨架催化作用运输作用 免疫作用运动作用调节作用 2 三 蛋白质的化学组成 一 蛋白质的元素组成基本元素 CHONS50 55 6 8 20 23 15 18 0 4 其他元素 某些蛋白质 PFeCuZnMoISe 3 蛋白质的含氮量 大多数蛋白质的含氮量接近于16 蛋白质氮占生物组织中所有含氮物质的绝大部分所以 可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量 蛋白质含量 克 每克生物样品中含氮的克数 6 25 4 二 蛋白质的分子组成 5 三 蛋白质的其他组分 蛋白质简单蛋白质结合蛋白质氨基酸部分非氨基酸部分糖脂核酸辅因子 6 三 蛋白质的基本单位 氨基酸 一 氨基酸的结构特点除甘氨酸和脯氨酸外 其他均具有如下结构通式 手性 碳原子 7 8 天然氨基酸除脯氨酸和甘氨酸外 其余均属于L 氨基酸 除甘氨酸外 氨基酸均含有一个手性 碳原子 因此都具有旋光性和立体异构 各种氨基酸的区别在于侧链R基团 Radical 不同 9 10 八种必需氨基酸 Thr Lys Val LeuIle Met Tyr Phe 苏赖缬亮异亮 甲硫酪苯丙 11 二 氨基酸的分类 1 常见的天然氨基酸 极性氨基酸 按极性分非极性氨基酸酸性氨基酸 按酸碱性分碱性氨基酸中性氨基酸 12 13 按营养状况分必需氨基酸非必需氨基酸2 稀有氨基酸是正常氨基酸的衍生物在遗传上没有直接的三联密码 3 非蛋白质氨基酸不在蛋白质分子中出现的氨基酸大多是 氨基酸的衍生物也有D 型和 氨基酸 14 三 氨基酸的理化性质 1 一般物理性质 无色晶体 熔点极高 一般在2000以上 不同氨基酸有不同的味感 能溶于稀酸或稀碱 不溶于有机溶剂 15 2 两性解离及等电点 氨基酸分子是一种两性电解质 通过改变溶液的pH可使氨基酸分子的解离状态发生改变 16 Pk2是AA的 NH3 被滴定一半时的pH NH3 释放H Pk1是AA的 coo 被滴定一半时的pH coo 结合H 氨基酸的解离曲线 17 等电点的概念 氨基酸分子上的 NH3 和 COO 解离度完全相同 氨基酸所带的净电荷为零 些时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点 等电点 pI 时溶解度最小 18 等电点的推导 19 移项 根据等电点的定义 Ala Ala 20 整理 K1K2 Ala Ala H H K1K2 H 2 两端取对数 lg H 2 lgK1 lgK2 lgK1 pk1 lgK2 pk2 2 lg H pk1 pk2 根据pH的定义得 pH lg1 H lg H 2pH pk1 pk2 pI 1 2 pk1 pk2 21 中性氨基酸 pI pK1 pK2 2酸性氨基酸 pI pK1 pKR COO 2碱性氨基酸 pI pK2 pKR NH2 2pK1指 羧基离解常数的负对数值 pK2指 氨基离解常数的负对数值pKR指侧链R基离解常数的负对数值 22 3 紫外吸收性质 色氨酸 酪氨酸和苯丙氨酸对紫外光有光吸收 其吸收峰在280nm左右 以色氨酸吸收最强 可采用紫外分分光度法测定蛋白质的含量 23 氨基酸的紫外吸收光谱 24 4 氨基酸的化学反应 1 茚三酮反应AA 水合茚三酮蓝紫色化合物 2 甲醛反应AA 甲醛二羟甲基氨基酸 3 亚硝酸反应AA 亚硝酸 羟氨基酸 氮气 水 加热 25 pH8 3 无水HF 26 AA与茚三酮反应 27 28 29 四 肽 peptide 一 肽的概念 30 肽 若干氨基酸通过肽键聚合而成的链状化合物 肽键 肽分子中 一个氨基酸分子的 羧基与另一个氨基酸分子的 氨基经脱水形成的酰胺键 CO NH 二肽 三肽 根据成肽的氨基酸数目命名 寡肽 10肽以下称之 多肽 10肽以上称之 氨基酸残基 氨基酸成肽后已不完整 故称之 肽单位 与肽键相连的六个原子 C 1 C O N H C 2 组成的肽平面 31 氨基酸残基与肽单位 32 33 氨基酸的顺序 指从 N 端 C 端氨基酸的排列顺序 肽的表示法 按氨基酸的顺序依次读为某氨酰某氨酰 某氨酸 如 谷氨酰半胱氨酰甘氨酸 简称 谷胱甘肽简式 Glu Cys Gly 二 肽结构的表示 34 三 生物活性肽 生物体内具有特殊的生物学活性的肽类物质 重要的有谷胱甘肽 神经肽 肽类激素等 35 1 谷胱甘肽 GSH 全称为 谷氨酰半胱氨酰甘氨酸 谷胱甘肽的生理功用 参与氧化还原反应解毒作用保护巯基酶的活性 36 谷胱甘肽 GSH 37 2 多肽类激素 种类较多 生理功能各异 主要见于下丘脑及垂体分泌的激素 38 H3N Tyr Gly Gly Phe Met COO H3N Tyr Gly Gly Phe Leu COO 3 神经肽 脑啡肽 Leo脑啡肽 有镇痛麻醉作用 39 五 蛋白质的结构 40 一 蛋白质的一级结构 1 蛋白质的一级结构的概念一级结构指多肽链的氨基酸组成 线性顺序 多肽链数目和关联 多肽链的氨基酸顺序 是蛋白质生物功能的基础 稳定一级结构的力 肽键 二硫键 41 胰岛素 Insulin 42 2 蛋白质一级结构的测定 蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础 自从1953年F Sanger测定了胰岛素的一级结构以来 现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定 43 3 一级结构测定的意义 一级结构是研究高级结构的基础 可以从分子水平阐明蛋白质的结构与功能的关系 可以为生物进化理论提供依据 可以为人工合成蛋白质提供参考顺序 44 45 细胞色素c的一级结构与生物进化的关系 46 1 样品纯化 纯度 97 以上 2 测定蛋白质的分子量 3 末端分析N端分析 PITC法DNFB法Edman法DNS CL法C端分析 肼解法 羧肽酶法4 拆分多肽链 可用8mol L尿素或6mol L盐酸胍处理5 用两种以上方法特异性裂解 肽链内切酶 胰蛋白酶 化学试剂 溴化氰 6 分离纯化肽段 双向电泳7 测定氨基酸组成 氨基酸自动分析仪 峰图 8 跨切口重迭肽段 分析氨基酸顺序 3一级结构测定的程序 47 PITC法测定N 端氨基酸残基 48 DNFB法分析N 端氨基酸残基 49 50 51 52 羧肽酶是一种肽链外切酶 它能从多肽链的C 端逐个的水解 羧肽酶A能水解除Pro Arg和Lys以外的所有C 末端氨基酸残基 根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量 从而知道蛋白质的C 末端残基顺序 羧肽酶法分析C 端氨基酸残基 羧肽酶B只能水解Arg和Lys为C 末端残基的肽键 53 蛋白质的特异裂解 54 胰蛋白酶 trypsin 的裂解作用 55 BrCN的裂解作用 56 氨基酸自动测序仪 57 58 确定肽段在多肽链中的次序 59 二 蛋白质的空间结构 蛋白质空间结构 构象 指蛋白质分子中原子和基团在空间的排列分布和肽链的走向 60 1 概述 何谓构象 构象是指一个由几个碳原子组成的分子 由于单键的旋转造成的不同碳原子上各原子或取代基团的空间排布 构象的改变不需要共价键的断裂和重组 只需要单键旋转方向和角度改变即可 conformation configuration 61 乙烷的构象 62 决定蛋白质空间构象的因素 蛋白质的氨基酸序列 肽键的刚性平面性质由于C O双键中的 电子云与N原子上的未共用电子对发生 电子共振 使肽键具有部分双键的性质 不能自由旋转 与肽键相连的六个原子构成刚性平面结构 称为肽单元或肽键平面 但由于 碳原子与其他原子之间均形成单键 因此两相邻的肽键平面可以 碳原子作相对旋转 旋转的相对角度称C 原子的两面角 和 可描述多肽的所有可能构象 63 64 66 R基团的性质和排布 空间位阻基团相互作用氢键离子键疏水键范德华力共价键 二硫键 酯键 67 稳定蛋白质构象的力 68 2 蛋白质二级结构 蛋白质的二级结构 指一级结构进一步盘绕折叠 其主链形成的局部构象 二级结构的类型 主要有 螺旋 折叠 转角 无规卷曲 维持二级结构的力 主要是氢键 69 70 左手 右手 螺旋 71 72 角蛋白分子中的二硫键 73 影响 螺旋稳定的因素 极大的侧链基团 存在空间位阻 连续存在的侧链带有相同电荷的氨基酸残基 同种电荷的互斥效应 有脯氨酸 羟脯氨酸的存在 不能形成氢键 74 75 76 折迭包括平行式和反平行式两种类型 77 78 79 80 4 无规卷曲的特征coil 无规卷曲是指多肽链主链部分形成的无规律的卷曲构象 81 RNase的分子结构 螺旋 折迭 转角 无规卷曲 82 超二级结构 模序 motif 在蛋白质分子中 若干具有二级结构的肽段在空间上相互接近 形成有规则的 空间上能够辩认的二级结构组合体 模序是蛋白质发挥特定功能的基础 如 等 83 84 锌指结构 螺旋 折迭 折迭模序 85 转录因子MyoD的螺旋 环 螺旋模序 86 结构域与分子整体以共价键相连 这是它与亚基的区别 结构域domain 多肽链在超二级结构基础上进一步盘曲折叠为紧密的近似球状的结构 在空间上彼此分隔 各自具有部分生物学功能的结构 87 图示 假设具有2个结构域的蛋白质的线性折叠途径 88 蛋白质的三级结构 是指蛋白质分子在二级结构基础上进一步盘曲折叠而形成的整体构象 也就是一条多肽链全部原子在三维空间的排布位置 4 蛋白质的三级结构 89 维系三级结构的力 主要是非共价键 次级键 如疏水键 氢键 盐键 范氏引力等 但也有共价键 如二硫键等 90 疏水作用是维持蛋白质结构最主要的稳定力 疏水基团因疏水作用而聚向分子内部 亲水基团多分布在分子表面 因此 具有三级结构的蛋白质都是亲水的 91 肌红蛋白的三级结构 92 溶菌酶分子的三级结构 93 胰岛素分子的三级结构 94 4 蛋白质的四级结构 蛋白质的四级结构 由两条或两条以上具有三级结构的多肽链相互缔结在一起的聚合体 其中每条具有三级结构的多肽链为一个亚基sub unit 维系蛋白质四级结构的力是次级键 由多个亚基聚集而成的蛋白质称为寡聚蛋白 95 血红蛋白 hemoglobin 的四级结构 96 血红蛋白的四级结构 97 亚基的立体排布 98 六 蛋白质分子结构与功能的关系 一 蛋白质一级结构与功能的关系1 一级结构与生物进化2 一级结构与分子病 二 蛋白质高级结构与功能的关系1 蛋白质变构与功能的关系2 蛋白质变性与功能的关系 99 100 七蛋白质的性质 一 胶体性质分子量很大很大的吸附力不能透过半透膜其水溶液是亲水胶体 101 蛋白质分子量的测定 超离心沉降法凝胶电泳法凝胶过滤法渗透压法 102 超离心沉降法 把蛋白质溶液放在25 50万倍重力场的离心作用下 使蛋白质颗粒从溶液中沉降下来 应用光学方法观察蛋白质的沉降行为 从而判断出蛋白质的沉降速率 计算出蛋白质的分子量 一般把单位 厘米 离心场中的沉降速率 称为沉降系数 用S表示 一个S单位等于1 10 13秒 蛋白质的分子量可以直接用S表示 103 二 蛋白质的两性解离与等电点 由于蛋白质分子中氨基酸残基的侧链上存在游离的氨基和游离的羧基 因此蛋白质与氨基酸一样具有两性解离的性质 因而也具有特定的等电点 104 在不同的pH环境下 蛋白质的电学性质不同 当溶液pH 等电点时 蛋白质粒子净电荷为零 在电场中不移动 当溶液pH 等电点时 蛋白质粒子带负电荷 在电场中向正极移动 当溶液pH 等电点时 蛋白质粒子带正电荷 在电场中向负极移动 105 106 三 蛋白质的变性与复性 1 蛋白质的变性 在某些物理或化学因素的作用下 蛋白质严格的空间结构被破坏 不包括肽键的断裂 从而引起蛋白质若干理化性质和生物学性质的改变 称为蛋白质的变性 denaturation 107 1 变性蛋白质的特征 物理性质 旋光性改变溶解度下降沉降率升高光吸收度增加 108 化学性质 官能团反应性增加易被蛋白酶水解生物学性质 原有生物学活性丧失抗原性改变 109 2 引起蛋白质变性的因素 物理因素 高温 高压 紫外线 电离辐射 超声波等 化学因素 强酸 强碱 有机溶剂 重金属盐 去污剂 尿素 110 2 蛋白质变性的复性 复性的概念 变性蛋白在一定的条件下 恢复其原有的的空间结构与生物活性的过程称之 影响复性的因素 变性的原因蛋白质的种类变性的程度 111 沉淀 蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称为沉淀 变性的蛋白质不一定沉淀 沉淀的蛋白质不一定变性 凝固 加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为凝固 112 核糖核酸酶的变性与复性 113 八蛋白质的分类 一 按分子形状分球状蛋白质 纤维状蛋白质 角蛋白毛发 指甲等 角蛋白蚕丝 蜘蛛丝等胶原蛋白皮肤 软骨等 114 二 按化学组成和溶解度分简单蛋白质结合蛋白质 三 按生物功能分结构蛋白收缩蛋白运输蛋白贮藏蛋白免疫蛋白调节蛋白酶 115 九蛋白质的分离纯化 116 二 分离纯化的方法和原理1 根据分子大小进行分离透析和超滤离心沉降凝胶过滤 凝胶层析 117 2 根据溶解度差异分离等电点沉淀盐析低温有机溶剂沉淀3 根据电离性质不同分离电泳离子交换层析4 根据分子与配基的亲和性质分离亲和层析 118 1 盐析与有机溶剂沉淀 盐析 概念 在蛋白