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实验八总RNA提取和反转录 1 实验目的 1 掌握TRIZol试剂法提取细胞总RNA的原理和实验步骤 2 掌握反转录 RT 的基本原理和操作步骤 总RNA提取 反转录 RT 聚合酶链式反应 PCR 检测目的基因的表达 2 通过变性剂破碎细胞或者组织 然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA 样品分成水样层和有机层 RNA存在于水样层中 收集水样层后 通过异丙醇沉淀RNA 再经过洗涤 晾干 最后溶解等步骤即得到相对较纯的RNA 反转录是在反转录酶的作用下 以总RNA中mRNA为模板合成cDNA的过程 实验原理 3 1 TRIzol试剂 主要成分是苯酚 它能裂解细胞 使细胞中的蛋白 核酸物质解聚并得到释放 此外 TRIzol中还有8 羟基喹啉 异硫氰酸胍 巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase 2 氯仿 与酚一起作用 使蛋白质变性 抽提水相中残留的酚 减少RNA损失 3 异丙醇 沉淀核酸 4 75 乙醇 DEPC水配制 去除RNA沉淀中的盐分 试剂的用途 4 实验步骤 1 取1 3小鼠完整肝组织 约1g 直接加入4mLTRIzol试剂 用匀浆器进行匀浆处理 室温放置5分钟 每组取0 5mL 2 加入0 1mL氯仿 剧烈振荡15s 室温放置3min 3 10000rpm离心5min RNA主要在上层水相中 转移0 3mL水相至新的离心管中 4 加入0 5mL异丙醇 轻轻混匀 室温静置5min 5 10000rpm离心5min 弃上清 6 加入1mL75 乙醇 轻轻洗涤RNA沉淀 10000rpm离心5min 弃上清 7 室温晾干 约5 10min 8 加入100 L无RNase水溶解RNA 取50 L用于A260和A280值测定 9 计算RNA的浓度和A260 A280值 总RNA提取 1只小鼠 小班 3个匀浆器 小班 5 1 在0 2mL微量离心管中配制混合液 2 轻轻混匀 离心 将样品沉至管底后 65 水浴保温5分钟 然后迅速冰浴冷却 反转录 RT 6 以下操作在冰上进行 3 往上述管中配制下列反转录反应液 4 缓慢混匀 稍稍离心将样品沉至管底 按下列条件进行反转录反应 42 保温30 60分钟 70 保温15分钟 然后冰上冷却 7 1 提取总RNA和反转录的整个过程都要严格控制RNase的污染 操作者要配带口罩 帽子和手套 所有用到的塑料和玻璃器皿均需要灭活RNase 2 反转录中 迅速冰浴的操作一定要快 不能是温度缓慢下降 否则RNA可能局部复性降低反转录的效率 3 反转录的反应中对RNA浓度有比较高的要求 因此必需测定RNA浓度 只有保证RNA浓度在合适的范围内才能提高扩增的成功几率 注意事项 8 28S 18S 5S 5 8S 12 A B A 细胞总RNA的制备 B RT PCR分析TBX5在不同细胞中的表达 9 思考题 RNA酶的变性或失活剂有那些
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