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鸡胚成纤维细胞的制备 鸡胚成纤维细胞的制备和培养 1 学习和掌握鸡胚成纤维细胞的制备和培养方法 了解原代细胞培养的原理和方法 实验目的 2020 3 19 2 CEF的培养是在一定条件下 在体外模拟体内生理环境 使从体内取出的成纤维组织细胞生存 生长和传代 并维持原有组织细胞的结构和功能特性 鸡胚成纤维细胞元代培养 2020 3 19 3 病毒能在易感的组织或单层细胞内增殖 并可产生细胞病变 因此 细胞培养是病毒学研究的重要手段 是进行病毒性疫苗生产和病毒性疾病诊断必不可少的工具 原代细胞培养是体外制备细胞培养物的必经过程 从供体体内取出组织分散成单个细胞接种于培养液中为初次培养 从初次培养到第一次传代培养为原代培养 本实验以鸡胚成纤维细胞作为原代细胞 通过细胞培养实践操作 认识和体会原代细胞的制备方法和影响细胞培养的主要因素 并掌握原代细胞培养的方法 实验原理 2020 3 19 4 超净工作台 检卵灯 灭菌的细胞培养瓶 眼科剪 眼科镊 平皿 吸管 离心管等 9 11日龄鸡胚 PBS 0 25 胰酶消化液 DMEM营养液 75 酒精棉 实验所需器材 试剂 2020 3 19 5 一 操作前的准备1 预热培养液 把已经配制好的生长液 Hanks液和胰蛋白酶液放入37 水浴锅内预热 2 用75 酒精棉擦拭双手和紫外线照射过的超净工作台 3 正确摆放要使用的器械 保证足够的操作空间 不仅便于操作而且可减少污染 4 点燃酒精灯 5 准备好将要使用的消毒后的培养瓶 6 取出预热好的培养用液 取出已经预热好的培养用液 用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内 实验步骤 2020 3 19 6 二 鸡胚成纤维细胞的制备1 鸡胚的处理 1 蛋壳消毒取9 11日龄的鸡胚 用检卵灯选取血管清楚 活动正常的鸡胚 置蛋架上 令气室端向上 用碘酒棉消毒蛋壳气室部位 2 胚体采集以镊子击破卵壳气室部位 并除去该部位卵壳 用无菌的眼科镊子撕开蛋壳气室膜并小心拨开绒毛尿囊膜和羊膜 用弯镊子夹住鸡胚颈部 移入灭菌的平皿内 用剪刀剪去胚头 四肢及内脏 用PBS洗去体表血液 移入灭菌小烧杯中 实验步骤 2020 3 19 7 3 胚体匀浆用灭菌剪将胚体剪碎至1mm3小碎块 加入PBS 淹住组织碎块即可 轻摇 静置1 2min 待组织块下沉 吸去上层悬液 重复2 3次 以除去其中的红细胞 至上悬液不混浊为止 移入灭菌的锥形瓶中 吸去PBS 实验步骤 2020 3 19 8 2 分散细胞 1 胰酶消化将剪碎的组织块放入锥形瓶中 加入适量的胰酶 包紧瓶口 37 水域消化30min 每隔5min轻轻摇动1次 当组织块变得蓬松透明时 吸弃消化液 用PBS洗两遍 中止消化 如再继续消化 可破坏细胞膜而不易贴壁生长 如果消化不够 则细胞不易分散 实验步骤 2020 3 19 10 2 分散细胞将消化好的细胞悬液从水浴锅中取出 弃去上层液体 加5mL含血清的DMEM生长液 DMEM营养液 5 犊牛血清 100IU ml青链霉素 用7 5 NaHCO3溶液调pH7 2 以吸管反复吹吸数次 使细胞分散 此时可见生长液混浊 即为细胞悬液 静置1min后 使未冲散的组织块下沉 3 过滤用4层脱脂纱布将吹打后的细胞过滤到平皿中 收集滤液 实验步骤 2020 3 19 11 三 分装与培养1 细胞计数用细胞计数器计数 根据计数结果 加入DMEM生长液 调整细胞浓度至50万 60万个 ml 实验步骤 2020 3 19 12 2 分装与培养在培养瓶中加入2mLDMEM生长液 如果是50mL的培养瓶 加4mL生长液 小心吸出过滤后的细胞悬液0 25mL至培养瓶中 如果是50mL的培养瓶 加0 5mL的细胞悬液 吹打均匀盖好瓶塞 在瓶上注明组别 日期 置37 温箱中培养 4h后细胞即可贴壁 24 36h生长成单层细胞 此时可更换培养液 并接种病毒 分装后2 4h不可大幅度移动培养瓶 以免影响细胞的贴壁和生长 实验步骤 2020 3 19 13 四 细胞形态观察检查时注意培养液的颜色变化 变黄但不混浊表示有细胞生长 变红表示细胞未生长或生长不佳 37 培养24 48h后 于倒置显微镜下观察 细胞可以长成单层 细胞透亮 呈纤维状 细胞膜清晰 实验步骤 2020 3 19 14 五 注意事项1 整个过程严格无菌操作2 培养液不要太多 应有足够的空间保证细胞对氧的需要3 放入CO2培养箱培养时 将CO2浓度控制在5 4 吸除消化液 向瓶内注入PBS数毫升 轻轻转动培养瓶 把残余消化液冲掉 注意冲洗细胞时 动作要轻 以免把已松动的细胞冲掉流失 如用胰蛋白酶液单独消化 吸除胰酶液后 可不用PBS冲洗 直接加入培养液 5 细胞培养对玻璃器皿洗涤要求严格 彻底洗涤后用蒸馏水冲洗 再用双蒸水冲洗 干燥灭菌后备用 所有的溶液都要用双蒸水配制 所用药品试剂用分析纯 实验步骤