萌发麦苗淀粉酶活力及水溶性蛋白含量的测定 实验报告.doc

. 萌发麦苗淀粉酶活力及水溶性蛋白含量的测定1、 研究背景及目的酶是由生物体内活细胞产生的一种生物催化剂。大多数由蛋白质组成（少数为RNA）。能在机体中十分温和的条件下，高效率地催化各种生物化学反应，促进生物体的新陈代谢。生命活动中的消化、吸收、呼吸、运动和生殖都是酶促反应过程。酶是细胞赖以生存的基础。细胞新陈代谢包括的所有化学反应几乎都是在酶的催化下进行的。因此，对酶的研究是十分重要的。通过对酶活性的测定，可以更好地了解生物体的代谢过程。其中，淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，可以分成-淀粉酶，-淀粉酶等。-淀粉酶既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地随机切断糖链内部的-1，4-链。-淀粉酶与-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断-1，4-葡聚糖链。 根据其催化产物的特点和现有测定方法规定酶活力单位为：每分钟每克鲜重麦种所催化产生的麦芽糖毫克数。3,5二硝基水杨酸法是一种对还原糖定量测定的方法。还原糖和碱性二硝基水杨酸试剂一起共热，产生一种棕红色的氨基化合物，在一定的浓度范围内，棕红色物质颜色的深浅程度与还原糖的量成正比。因此，我们可以测定样品中还原糖以及总糖的量。麦芽糖是还原性糖，可用该方法对其含量进行测定。 本次实验的目的在于通过实验过程，理解淀粉酶测定的原理，熟悉实验操作，掌握实验方法。蛋白质是生物体中广泛存在的一类生物大分子，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质，对生物来说十分重要。目前有四种蛋白质含量测定方法：凯氏定氮、Folin-酚法、染料结合法、紫外法，最常用的是后三种。本次实验选择通过Folin-酚法测定蛋白质含量。这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难，近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。2、 实验原理 该实验的总体思路为精确控制酶促反应的条件，保持其处于最适条件，测定酶促反应的初速度来表示酶的活力。以及通过化学反应使得蛋白质具有特异光吸收，再通过比色法测定蛋白质含量。该实验的理论基础为：（1） 酶的性质：淀粉酶是蛋白质，在一定的条件下会发生钝化，可利用此性质将体系中的非目标酶类钝化，从而测出目标酶类的活力；（2） 3,5二硝基水杨酸法：3,5二硝基水杨酸法是一种对还原糖定量测定的方法。还原糖和碱性二硝基水杨酸试剂一起共热，产生一种棕红色的氨基化合物，在一定的浓度范围内，棕红色物质颜色的深浅程度与还原糖的量成正比。因此，我们可以测定样品中还原糖以及总糖的量。麦芽糖是还原性糖，可用该方法对其含量进行测定。 具体反映为：在加热、碱性条件下：3,5二硝基水杨酸（黄色）+还原糖3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色）+糖酸；（3） 比色法原理：朗伯比尔定律（当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时,与其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比）。3、 仪器试剂1、仪器设备：上海精宏实验设备有限公司DK-S24型40水浴锅；天津市中环实验电炉有限公司22列八孔型70电热恒温水浴锅；上海安亭科学仪器厂TDL-408型低速离心机；上海精密科学仪器有限公司722型光栅分光光度计；DCL-2000 DY型电磁炉（佛山市爱庭电器有限公司）。2、主要实验器皿：50ml容量瓶，100ml容量瓶，研钵一套，具塞刻度试管若干，试管若干，烧杯。3、试剂：（1）麦芽糖标准液（1mg/ml）；（2） pH5.6的柠檬缓冲液：A液（称取柠檬酸20.01克，溶解后定容至1L）B液（称取柠檬酸钠29.41克，溶解后定容至1L）取A液5.5ml、B液14.5ml混匀即为pH5.5柠檬酸缓冲液；（3）3，5-二硝基水杨酸溶液（称取3，5-二硝基水杨酸1.00克，溶于20ml 1M氢氧化钠中，加入50ml蒸馏水，再加入30克酒石酸钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100ml，盖紧瓶塞，勿使二氧化碳进入）；（4）麦芽糖标准液（称取0.100克麦芽糖，溶于少量蒸馏水中，小心移入100ml容量瓶中，用蒸馏水定容到100ml）；（5）0.4M NaOH；（6） 试剂甲： （A） 10克 Na2CO3，2克 NaOH和0.25克酒石酸钾钠 （KNaC4H4O64H2O）。溶解于500毫升蒸馏水中。 （B） 0.5克硫酸铜（CuSO45H2O）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（A）与1份（B）混合，即为试剂甲。 （7） 试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO42H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO42H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克 硫 酸 锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。 （8） 牛血清蛋白标准溶液（250g/ml）。4、实验材料：萌发的小麦种子。4、 实验步骤（1）酶液的制备（蒸馏水浸提）：称取2克萌发的小麦种子（芽长一厘米左右），置于研钵中加少量石英砂，蒸馏水作为匀浆液，研磨成匀浆，转移到50ml容量瓶中至40ml左右，浸提15-20分钟，用蒸馏水定容到刻度，混匀后3500转/分离心20分钟，取出上清液备用（初始酶液）。（2）淀粉酶活性的测定： A.取试管4支，注明两支为对照管，两支为测定管。 B.于每个管中各加入酶提取液1毫升，在70恒温水浴中（水浴温度的变化不应超过0.5）准确加热15分钟，取出后迅速在水浴中彻底冷却。 C.在试管中各加入1ml pH5.6柠檬酸缓冲液。 D.将测定管和对照管置于40（0.5）恒温水浴中准确保温15分钟后，向两支对照管中各加入4ml 0.4MNaOH，再向各管分别加入40下预热的淀粉溶液2ml，摇匀，立即放入40水浴中准确保温5分钟后，向两支测定管分别迅速加入4ml 0.4NaOH，然后准备下步糖的测定。（3）-淀粉酶及-淀粉酶总活性的测定：取酶液5ml，放入100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。混均后，取4支试管，2支为对照管，2支为测定管，各加入稀释后酶液1ml及pH5.6柠檬酸缓冲液1ml，以下步骤重复淀粉酶测定的第D的操作。（4）麦芽糖的测定：a.标准曲线的制作取15ml具塞刻度试管7支，编号，分别加入麦芽糖标准液（1mg/ml）0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0毫升，然后将各管用蒸馏水准确补充到1.0毫升，摇匀后再加入3,5-二硝基水杨酸1毫升，摇匀，在沸水浴中准确保温5分钟，取出冷却，用蒸馏水稀释到15毫升，混均匀后用分光光度计在520nm波长下进行比色，记录消光值，以消光值为纵坐标以麦芽糖含量为横坐标绘制标准曲线。b.样品的测定取以上各管中酶作用后的溶液及对照管中的溶液各1毫升，分别放入15毫升具塞刻度管中，在加入1毫升，3,5-二硝基水杨酸试剂混匀，置于沸水浴中准确煮沸5分钟，取出冷却，用蒸馏水稀释至15毫升，混匀，用分光光度计在520nm波长下进行比色，记录消光值，根据标准曲线，进行结果计算。（5） 水溶性蛋白的测定A.标准曲线的测定：取6支大试管分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，迅速混匀，于室温（2025）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin酚试剂），同样立即混匀。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于650nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制出标准曲线。B.样品的测定 取酶液2ml，加入6ml蒸馏水，作为待测液。按上述方法进行操作，同时进行。根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。 （6）结果计算-淀粉酶活性（毫克麦芽糖克-1鲜重分钟-1）= 毫克麦芽糖克-1鲜重分钟-1（-+-）淀粉酶总活性（毫克麦芽糖克-1鲜重分钟-1）= 毫克麦芽糖克-1鲜重分钟-1A -淀粉酶测定管中的麦芽糖浓度A -淀粉酶对照管中的麦芽糖浓度B -及-淀粉酶总活性测定管中的麦芽糖浓度B -及-淀粉酶总活性对照管中的麦芽糖浓度5、 数据整理与计算麦芽糖标准曲线：管号1234567麦芽糖标准液浓度15(mg/ml)00.10.30.50.70.91.0OD5200.0000.0240.1590.3060.4400.5420.639淀粉酶活力测定液：管号89101112131415项目-对照管-测定管+-对照管+-测定管OD5200.2180.2090.3510.339-0.008-0.0080.1330.129OD520均值0.2140.345-0.0080.131麦芽糖浓度（mg/ml）0.0230.037-0.0010.014水溶性蛋白标准曲线：管号123456蛋白质浓度（g/ml) 050100150200250OD65000.1290.2480.3690.4620.551水溶性蛋白测定液：管号789OD6500.5100.4850.495OD650均值0.497蛋白质含量2.16%6、 结果计算与讨论分析A -淀粉酶测定管中的麦芽糖浓度A -淀粉酶对照管中的麦芽糖浓度B -及-淀粉酶总活性测定管中的麦芽糖浓度B -及-淀粉酶总活性对照管中的麦芽糖浓度A=0.037mg/ml；A=0.023mg/ml；B=0.014mg/ml；B=-0.001mg/ml-淀粉酶活性（毫克麦芽糖克-1鲜重分钟-1）= 0.56毫克麦芽糖克-1鲜重分钟-1；（-+-）淀粉酶总活性（毫克麦芽糖克-1鲜重分钟-1）= 12毫克麦芽糖克-1鲜重分钟-1； 在对+-对照管的麦芽糖浓度进行测定时，它的消光值为负值。经查阅资料，我们认为出现复制的原因是空白管的浓度低于所测管的浓度。根据标准曲所拟合的方程，+-对照管的麦芽糖浓度为负值显然是不合理的，但是，为了保证+-测定管与+-对照管中的浓度之差计算准确，暂且将+-测定管中的麦芽糖浓度表示为负值，该表示不具有实际意义，仅为计算服务。经计算，（-+-）淀粉酶总活性远高于-淀粉酶活性。若通过直接相减得到淀粉酶活性，则淀粉酶活性将会远高于-淀粉酶活性。我们知道，-淀粉酶既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地随机切断糖链内部的-1，4-链。大多淀粉酶(个别品种除外)不能切断1，6甙键，也不能切断分支点附近的1，4甙键2。其水解淀粉的产物主要是高含量的麦芽糖和一些低聚糖及少量的葡萄糖1，这些均为还原性糖。-淀粉酶与-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断-1，4-葡聚糖链。-淀粉酶的唯一产物是麦芽糖。资料显示，休眠的种子中只存在-淀粉酶，而-淀粉酶是在种子萌发的过程中形成的。因此可以猜测，我们所使用的正在萌发的小麦种子中，-淀粉酶刚刚开始形成，-淀粉酶的含量依然远高于-淀粉酶，所以反映出-淀粉酶活性远高于-淀粉酶。萌发的小麦种子中并不只含有-淀粉酶和-淀粉酶这两种淀粉水解酶类，还可能存在脱支酶、纤维素外切酶等多种酶类，以及大量其他的化学物质。本次实验的测定包括加热、加入缓冲液等步骤，均有可能导致提取液中的组分发生作用，影响酶的活性。另外，-淀粉酶和-淀粉酶之间可能存在相互促进的作用，当两种酶同时存在时可极大地提高其催化效率。本次实验测得小麦种子中水溶性蛋白的含量为2.16%，与绿豆芽中的蛋白质含量数量级一致。说明生物之间有一定的共性。7、 结论与展望通过该实验，我们得到如下结论：（1） （-+-）淀粉酶总活性远高于-淀粉酶的活性；（2） 其机理尚不清楚，需要通过进一步的实验进行探究；（3） 小麦种子中水溶性蛋白的含量为2.16%；（4） 该实验的总体思路正确，可以得出可靠结果。针对以上结论，本次实验验证了测定酶活力的总体思路，为今后的实验做出了指导。另外，要进一步验证实验中出现的问题，可以钝化-淀粉酶，单独测定-淀粉酶的活性，同时测定（-+-）淀粉酶总活性。若-淀粉酶活性的确远高于-淀粉酶，则这两种淀粉酶没有协同作用，否则它们就极可能存在相互作用。8、 思考题及质疑1、淀粉酶活性测定时70水浴为何要严格保温15分钟？保温后为什么要立即于冰浴中骤冷？而经如此处理，为什么在随后的40温浴和酶促反应中就能保证b-淀粉酶不会再参与催化反应。-淀粉酶不耐高温，严格保温15分钟是为了使-淀粉酶钝化，而保持-淀粉酶的活性正常。若时间过短，则可能导致-淀粉酶钝化不彻底，若时间过长则可能影响-淀粉酶的活性。骤冷的目的在于使得-淀粉酶的不能复性。因为蛋白质变形之后，只有在条件缓慢恢复到适宜条件的情况下，蛋白质才可能复性。骤冷保证了-淀粉酶的天然构象被彻底破坏，不可恢复，就保证了-淀粉酶不会再参与催化反应。2、 酶的最适反应温度（一般都是生理温度）和最适保存温度（一般0以下）为什么不一样？而这两个状态都是需要维护酶的空间结构。酶的最适反应温度是酶的活性最高的问题，而酶的最适保存温度是让酶的活性维持的时间最长的温度。酶在高温下易失活，在低温下活性降低但是不会彻底失活，当酶回到最适温度下，酶的活性会恢复到最大。如果酶长时间保存在常温或者是最佳活性温度的话一方面会造成酶的部分降解，另一方面会造成的酶活性的下降。低温保存有利于降低分子间的相互作用，维持酶分子的结构，降低酶失活的速率。3、 为什么3，5-二硝基水杨酸与还原糖的反应要先沸水浴然后再稀释测定？因为当反应物浓度较大时反应进行的较为迅速、彻底，3，5-二硝基水杨酸与还原糖的反应需要在加热的条件下进行，所以先用沸水浴使其充分反应，再将其稀释到朗伯比尔定律范围内，用比色法测定其浓度。4、 在设计酶活测定的实验时，要求酶促反应初速度对底物浓度的小量变化不敏感，具体要求为：在底物浓度有10%的变化幅度范围内，而所测初速度的变化幅度小于1%。则【S】/KM应该大于多少才能保证这一点？（设定为米氏酶）由米氏方程得，v=根据题意，当【S】=1.1【S】,0.99vv110.5、 转氨酶在细胞内的作用及生理意义？细胞内有众多的转氨酶，但相关研究及医学临床应用中却几乎都是只检测谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）的活力，而极少测定其它转氨酶活力，你推测可能的原因会是什么？为什么？转氨酶是催化氨基酸与酮酸之间氨基转移的一类酶。在细胞中，转氨酶参与氨基酸的分解和合成。氨基酸转氨后生成的酮酸或醛酸可经氧化分解而供能，也可转变成糖类或脂肪酸。相反，酮酸或醛酸也可经转氨酶的作用而生成非必需氨基酸。某些氨基酸之间的互变也有转氨酶参与。转氨酶是人体肝脏正常运转过程中必不可少的“催化剂”。在转氨酶类中，以谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）最为重要。前者是催化谷氨酸与丙酮酸之间的转氨作用，后者是催化谷氨酸与草酰乙酸之间的转氨作用。丙酮酸是糖酵解的最终产物，可转化成多种物质继续供能，草酰乙酸是TCA循环中重要的一环，还是糖异生的中间产物。丙酮酸和草酰乙酸都是能量代谢中重要的中间产物。在高等动物各组织中，活力最高的转氨酶是谷氨酸 ：草酰乙酸转氨酶（ GOT ）和谷氨酸：丙酮酸转氨酶（GPT）。 6、 转氨酶催化的是双底物可逆反应，根据酶活力测定的总体思路，要保证测定反应的初速度，根据实验指导所提供的资料，你认为是否保证了这一点？是如何保证的？我认为保证了这一点，首先是通过添加大量底