11 生物化学实验--核酸的定性分析.doc

. 核酸的定性分析 【目的】 1 掌握测定核酸 的组成从而 定性分析 DNA 或 RNA 的方法。 2 熟悉测定核酸的组成从而定性分析 DNA 或 RNA 的 原理。 【原理】 RNA 和 DNA 均可被硫酸水解生成含氮碱（嘌呤碱与嘧啶碱）、戊糖（ RNA 中的核糖与 DNA 中的脱氧核糖）和磷酸。水解产物可用下列方法鉴定。 1 嘌呤碱的鉴定原理 嘌呤碱在弱碱性环境中能与硝酸银作用形成嘌呤银化合物。初为乳白色，稍放久为浅灰褐色絮状物。 2 核糖的鉴定原理 核糖经浓盐酸或浓硫酸作用，脱水生成糠醛，后者能与 3 ， 5- 二羟甲苯缩合形成鲜绿色化合物。该反应需三氯化铁作为催化剂。 3 脱氧核糖的鉴定原理 脱氧核糖在浓酸中脱水生成 - 羟基 - 酮基戊醛，后者与二苯胺作用生成蓝色化合物。 4 磷酸的鉴定原理 定磷试剂中的钼酸铵在酸性环境中以钼酸形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸。后者在还原剂氨基萘酚磺酸作用下形成蓝色的钼蓝。 【器材】 1 试管与滴管 2 PH 试纸 3 沸水浴 4 带有长玻璃管的胶塞 【试剂】 1 5% 硫酸 2 5% 硝酸银溶液 3 浓氨水 4 3,5- 二羟甲苯试剂 取 FeCl 3 6H 2 O 1.0g 溶于 6ml 水中，加浓盐酸 100ml ，混匀，此为 A 液。另配制 6%3,5- 二羟甲苯乙醇溶液为 B 液。临用时用 A 液 100ml 加 B 液 3.5ml 混合即可。 5 二苯胺试剂 取二苯胺 1.0g 溶于 100ml 冰乙酸中，加浓硫酸 2.75ml 。此二苯胺试剂遇光易变绿色，故临用前配制，贮于棕色瓶中，置冰箱保存。 6 钼酸试剂 取钼酸铵 2.5g 溶于 20ml 水中，加浓硫酸（ AR ） 8.5ml, 冷却后再加水至 100ml ，放冷处可保存 4 周左右。 7 氨基萘酚磺酸溶液 取 15% 亚硫酸氢钠溶液 195ml 与 20% 亚硫酸钠溶液 5ml 混合，加氨基萘酚磺酸 0.5g ，在热水浴中搅拌使固体溶解（如不全溶，可滴加 20% 亚硫酸钠数滴，至多不超过 1ml 即可）。此溶液置冷处可保存 2-3 周，如颜色变黄需重新配置，临用前将上述溶液以蒸馏水稀释 10 倍应用。 8 核酸样品 称取粗制核酸样品 10mg/ 每组。或者，取本教材实验九从动物组织中提取出的核酸作为本次实验的样品。 【操作】 1 核酸的水解 向加入 10mg 核酸样品的试管（或者，向有核酸沉淀的离心管）中加入 5% 硫酸 4ml ，用玻璃棒搅匀，再用带长玻璃管的塞子塞紧管口，于沸水浴中加热 15min ，既得核酸的水解液。 2 核酸的鉴定 （ 1 ）嘌呤碱的鉴定：取小试管 2 支，分别标明测定与对照，按下表依次加入试剂，混匀，放置 15min ，观察嘌呤银沉淀的生成，并记录颜色。 试管 水解液 5%H 2 SO 4 浓氨水 5% 硝酸银 颜色 测定管 20 滴 数滴，呈碱性 10 滴 对照管 20 滴 数滴，呈碱性 10 滴 注：加氨水（约 2 3 滴）以中和酸，呈碱性即可，需用 PH 试纸测试。若加氨水过多，则生成银氨络离子 Ag(NH 3 ) 4 + ，使银离子减少，嘌呤银沉淀减少。 （ 2 ）核糖的鉴定：取试管 2 支，分别标明测定与对照，按下表操作： 试管 水解液 5%H 2 SO 4 3,5- 二羟甲苯试剂 颜色 测定管 4 滴 6 滴 对照管 4 滴 6 滴 将两管同时放入沸水浴加热 15min ，观察颜色变化并记录。（煮 3 5min ，即可先观察） （ 3 ）脱氧核糖的鉴定：取试管 2 支。分别标明测定与对照。按下表操作 : 试管 水解液 5%H 2 SO 4 二苯胺试剂 颜色 测定管 20 滴 30 滴 对照管 20 滴 30 滴 将两管同时放入沸水浴中加热 10min ，观察颜色变化并记录。 （ 4 ）磷酸的鉴定：取试管 2 支，分别标明测定与对照，按下表操作： 试管 水解液 5%H 2 SO 4 钼酸 氨基萘酚磺酸 颜色 测定管 10 滴 40 滴 20 滴 对照管 10 滴 40 滴 20 滴 于室温放置 10min 后，观察颜色变化并记录。 【注意事项】 1 为了安全，核酸水解时，避免将 长玻璃