C3核酸的光谱学和热力学特性.ppt

核酸的光谱学和热力学特性 要点 核酸的紫外光吸收DNA的纯度核酸定量减色效应和增色效应热变性及复性 嘌呤 purine 腺嘌呤 adenine A 鸟嘌呤 guanine G 嘧啶 pyrimidine 胞嘧啶 cytosine C 尿嘧啶 uracil U 胸腺嘧啶 thymine T 核酸的紫外吸收 嘌呤环和嘧啶环中含有共轭双键 因而都有吸收紫外光的性质 吸收高峰在波长260nm左右 减色效应 单一核苷酸 RNA和ssDNA dsDNA 这种dsDNA相对于ssDNA吸收值减少的现象就成为减色效应 dsDNA吸收值之所以最少 是由于碱基在疏水环境中的堆积所造成的 在研究核酸 核苷酸 核苷及碱基时 可以此对核酸进行定性及定量分析 另外 紫外线照射可引起DNA突变 也是由于存在于DNA中的核苷酸吸收紫外光所造成的 OD260的应用 核酸定量 1 DNA或RNA的定量OD260 1 0相当于50 g ml双链DNA40 g ml单链DNA 或RNA 20 g ml寡核苷酸2 判断核酸样品的纯度DNA纯品 OD260 OD280 1 8RNA纯品 OD260 OD280 2 0 核酸定量 在研究核酸 核苷酸 核苷及碱基时 可以此对核酸进行定性及定量分析 DNA纯度 dsDNA的A260 A280 1 8RNA的A260 A280 2 0蛋白质的最大吸收峰为280nm如果A260 A280 1 8 说明有RNA污染 如果A260 A280 1 8 说明有蛋白质污染 溶解性 RNA和DNA是极性的化合物都微溶于水不溶于乙醇乙醚 氯仿等有机溶剂 在生物细胞内都与蛋白质结合成核蛋白 DNA核蛋白 DNP 与RNA核蛋白 RNP 的溶解度受溶液的盐浓度的影响而不同 DNP溶于水和浓盐溶液 在1mol L的NaCl溶液中溶解度比纯水高2倍 但在0 14mol L的NaCl溶液中溶解度最低 仅为水的1 几乎不溶解 RNP在盐溶液中其溶解度受盐浓度的影响较小 在0 14mol L的NaCl溶解度较大 因此 在核酸的提取中 常用此法将两种核蛋白分开 然后用蛋白质变性剂去除蛋白质 核酸的热变性与复性 变性 denaturation 核酸的变性是指核酸的互补配对碱基之间的氢键断裂 而构成磷酸 戊糖骨架的3 5 磷酸二酯键并未发生变化 温度升高 溶液的盐浓度降低 或者溶液的酸碱度改变 都可以使核酸发生变性 实验室中最常用的使DNA分子变性的方法之一是加热 DNA分子的变性可以导致A260增加 变性引起紫外吸收值的改变 DNA的紫外吸收光谱 增色效应 DNA变性时其溶液OD260增高的现象 RNA随温度升高碱基堆积会逐渐减少 光吸收值会逐渐地 不规则地增大 dsDNA升温过程中 分子末端及内部富含A T的区域的变性将会使其附近的螺旋变得不稳定 从而导致整个分子结构在一个确定的温度共同变性 这一温度取过渡期的中点值 称为解链温度 meltingtemperature 以Tm表示 Tm值计算公式为 Tm 69 3 41 G C 少于20个碱基的寡核苷酸的Tm 4 G C 2 A T DNA的复性 DNA复性 renaturation 的定义在适当条件下 变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象 这一现象称为复性 DNA复性时 其溶液OD260降低 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性 这一过程称为退火 annealing 在DNA变性后的复性过程中 如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中 只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系 在适宜的条件 温度及离子强度 下 就可以在不同的分子间形成杂化双链 heteroduplex 这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成 也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成 这种现象称为核酸分子杂交 核酸分子杂交 hybridization 与探针的杂交 讨论题A同学做基因表达谱分析实验时从大豆的根中提取RNA样品 她将纯化的RNA样品溶解在20 l的DEPC处理水中 然后取2 l加480 l纯水使总体积达到500 l 再转移到比色杯中 用紫外分光光度计测RNA样品的浓度并考察该样品的纯度 她测定的数据如下图所示 请你根据这些数据说明